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棘球蚴病(又称为包虫病)是棘球绦虫的幼虫(棘球蚴)寄生于人和动物的肝、肺等组织器官而引起的一种重要的人兽共患寄生虫病,广泛分布于全球以农牧业生产为主的地区,严重危害人类健康和畜牧业发展,是全球重要的公共卫生问题。髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是髓系来源的异质性细胞群,在细粒棘球绦虫原头节感染小鼠的脾脏和外周血中明显富集。根据形态特征和表型将MDSCs分为两个亚群,即多型核MDSCs(polymorphonuclear MDSCs,PMN-MDSCs)和单核MDSCs(monocytic MDSCs,M-MDSCs),两亚群细胞分别通过不同的机制发挥免疫调节功能,并且M-MDSCs在单个细胞基础上比PMN-MDSCs具有更强大的免疫抑制功能。然而,MDSCs及其亚群在细粒棘球蚴感染小鼠的原发感染灶以及外周淋巴器官中的分布以及变化情况并不十分清楚,并且MDSCs具体的免疫抑制作用机制有待阐明。本研究构建细粒棘球绦虫原头节感染小鼠模型,在感染晚期通过流式细胞术检测MDSCs及其亚群的分布情况。通过小鼠lncRNA芯片检测以及生物信息学分析,比较细粒棘球绦虫原头节感染小鼠脾脏M-MDSCs源lncRNA和mRNA表达谱,对差异性表达lncRNA进行筛选和鉴定,分析lncRNA表达水平改变的意义,初步探索参与M-MDSCs免疫调控功能的lncRNA分子。lncRNA能够以多种机制影响靶基因的表达,并且lncRNA含有某些microRNA(miRNA)结合位点,通过与其它RNA转录体竞争相同的miRNA,降低miRNA对靶基因的抑制作用,形成了竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控机制。本研究通过小鼠lncRNA芯片开展脾脏M-MDSCs源lncRNA差异表达谱研究,结合课题组前期小鼠脾脏M-MDSCs源miRNA芯片结果,利用生物信息学分析构建lncRNA-mRNA-miRNA调控网络,研究可能以ceRNA角色影响M-MDSCs免疫调控功能的lncRNA分子。一、细粒棘球绦虫原头节感染小鼠髓源抑制性细胞比例的变化及意义构建细粒棘球绦虫原头节感染BALB/c小鼠模型,感染组每只小鼠腹腔注射原头节2 000个,对照组注射等量生理盐水。于感染8个月后,收集感染组和对照组小鼠脾脏、外周血白细胞及腹腔细胞,采用流式细胞术检测小鼠MDSCs及亚群(M-MDSCs、PMN-MDSCs)和Th17细胞的比例,采用Pearson相关性分析MDSCs、M-MDSCs、PMN-MDSCs与Th17细胞比例的相关关系。分析细粒棘球绦虫原头节感染小鼠体内MDSCs和Th17细胞的比例变化并探讨该变化的意义。结果显示,感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中MDSCs比例分别为(14.72±4.27)%、(57.04±6.78)%和(15.35±5.56)%,对照组分别为(8.84±2.12)%、(30.53±1.58)%和(1.74±0.63)%,两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中M-MDSCs 比例分别为(1.29±0.24)%、(6.27±2.11)%和(2.14±0.94)%,对照组分别为(0.72±0.25)%、(2.11±1.27)%和(0.25±0.06)%,两组间差异均具有统计学意义(p<0.05)。感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞中PMN-MDSCs 比例分别为(9.31±2.65)%、(46.72±5.67)%和(7.06±2.36)%,对照组分别为(7.07±3.20)%、(25.42±2.05)%和(1.08±0.40)%,两组间外周血白细胞和腹腔细胞的PMN-MDSCs比例差异具有统计学意义(P<0.05)。感染组小鼠脾脏细胞、外周血白细胞、腹腔细胞细胞中Th17细胞比例分别为(1.31±0.38)%、(1.85±0.77)%和(2.90±0.24)%,对照组分别为(0.59±0.07)%、(0.35±0.15)%和(0.41 ±0.12)%,两组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示:感染组脾脏、外周血白细胞和腹腔细胞中MDSCs与Th17细胞比例之间均未见相关关系(r=-0.354、-0.746、0.801,P>0.05);感染组脾脏单核细胞型MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系(r=-0.896,P<0.05)。细粒棘球绦虫原头节感染小鼠感染晚期,MDSCs与Th17细胞均增加,感染小鼠脾脏M-MDSCs与Th17细胞比例呈负相关关系。二、细粒棘球绦虫原头节感染小鼠单核髓源抑制性细胞lncRNA表达谱分析通过分析比较细粒棘球绦虫原头节感染小鼠脾脏单核髓源抑制性细胞lncRNAs和mRNAs表达模式,对差异性表达lncRNA进行筛选和鉴定,探讨lncRNA表达水平改变的意义。利用GO和Pathway分析对差异表达的lncRNA的功能进行预测。Cis/trans分析lncRNA对靶基因的调控和与转录因子之间的关系。结果显示,感染小鼠与正常小鼠脾脏M-MDSCs中,共有649个差异表达lncRNAs,其中582个lncRNAs表达上调,67个lncRNAs下调。差异表达mRNAs共1071个,其中28个mRNAs表达上调,1043个mRNAs表达下调。随机挑选10个差异表达的lncRNAs分子,在正常小鼠和感染小鼠M-MDSCs样本中通过荧光定量PCR检测,对芯片检测结果进行验证。结果显示,lncRNAs在基因芯片水平和组织水平表达水平一致。GO和KEGG分析显示,差异表达lncRNAs主要参与的信号通路包括:调控肌动蛋白细胞骨架(regulating the actin cytoskeleton)、沙门菌感染(Salmonellainfection)、利什曼病(leishmaniasis)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号通路等。lncRNAs靶基因预测研究发现,其中288个lncRNAs具有cis调节机制,372个lncRNAs与60个转录因子之间存在相互调控关系。本研究获得了细粒棘球绦虫原头节感染小鼠脾脏M-MDSCs差异表达lncRNAs谱,这些lncRNAs可能通过相关通路或与靶基因相互作用的方式,在M-MDSCs发挥免疫调节功能中发挥作用。三、细粒棘球绦虫原头节感染小鼠脾脏M-MDSCs竞争性内源RNA网络调控分析lncRNA能够以ceRNA的形式,通过与mRNA竞争相同的miRNA反应元件从而影响转录本的表达,并构成庞大的ceRNA网络(ceRNETs)。本研究根据细粒棘球绦虫原头节感染小鼠M-MDSCs源lncRNA/mRNA表达谱,结合课题组成员前期获得的细粒棘球绦虫原头节感染小鼠M-MDSCs源差异表达miRNA,通过生物信息学分析,预测并筛选在细粒棘球蚴感染小鼠中,可能以ceRNA作用模式参与调控M-MDSCs发挥免疫抑制作用的lncRNAs,并探索lncRNA-miRNA-mRNA互作调控网络。对具有ceRNA机制的lncRNAs进行GO/KEGG分析,共获得207个ceRNA(lncRNA-miRNA-mRNA)关系组合,其中差异表达的lncRNAs在生物学进程中,主要涉及细胞周期(cell cycle)、有丝分裂(mitotic nuclear division)和细胞分裂(cell division)等;分子功能主要包括白介素-1受体活性(interleukin-1 receptor activity)、催化活性(catalytic activity)以及ATP结合(ATP binding)等功能;细胞组分主要涉及染色体着丝粒区(chromosome centrometric region)、染色体(chromosome)以及细胞核(nucleus),主要存在于细胞核和染色质等。KEGG pathway分析显示,ceRNA调控网络中,mRNAs主要参与的信号通路包括:DNA复制(DNAreplication)、细胞周期(cell cycle)和错配修复(mismatch repair)等。这些lncRNA可能以ceRNA角色通过竞争性结合miRNA调控靶基因水平,从而影响M-MDSCs的免疫抑制功能。