弯曲杆菌（Campylobacter）是微需氧的革兰氏阴性细菌,可以通过动物、食物和水传播,是人类胃肠道疾病的主要病因,对人类健康构成极大威胁。近十年来,随着动物源新型弯曲杆菌不断被发现,人畜共患病问题凸显。因此,对动物源弯曲杆菌的分离鉴定、检测、流行病学调查、传播途径、耐药性和毒力进行深入研究,有助于科学预防弯曲杆菌大规模爆发流行,保障人类健康。本文以新兴的几种弯曲杆菌,如乌普萨拉弯曲杆菌（Campylobacter upsaliensis）和瑞士弯曲杆菌（Campylobacter heveticus）为研究对象,建立其分离和检测方法,并调查其在动物（猫狗宠物）的流行状况分析同源性、进行耐药性测试和主要毒力因子cdt的毒理学分析,为预防和控制由弯曲杆菌引起的动物、食品和人类安全隐患提供科学依据。主要内容如下:1.通过培养温度、气体环境、选择性接种平板的测试、变形杆菌的抑制探索及选择性富集培养基的测试,确定了弯曲杆菌在血琼脂平板上的培养条件:密封干燥罐内,10%H2、10%CO2和80%N2的气体环境,37℃培养48 h;变形杆菌和弯曲杆菌的分离培养基为添加4%乙醇的血琼脂平板滤膜法和CAT平板,富集培养基为添加20 mg/m L Vancomycin的Bolton肉汤。2.以看家基因16S r RNA,cpn60,gyr B以及弯曲杆菌毒力基因cdt B作为靶基因,通过引物设计和筛选、扩增体系优化、特异性、灵敏度和加标实验,建立的多重PCR鉴定方法可提高目标菌株的检出率,其中,C.helveticus最终检出限为1.7×10~1 CFU每反应体系,C.upsaliensis为1.1×10~1CFU每反应体系,C.mucosalis为1.2×10~2CFU每反应体系,体系具有良好的特异性和稳定性。3.采用建立的培养方法和多重PCR法对2家动物医院采集的115份宠物粪便样品进行新兴弯曲杆菌的分离和鉴定,结果显示弯曲杆菌阳性检出率为29.6%,其中C.upsaliensis的总检出率为17.4%,在猫狗粪便中的检出率分别为13.9%和18.9%;C.helveticus的总检出率为7.0%,在猫狗粪便样品中的检出率分别为19.4%和1.3%。4.通过对限制性内切酶的筛选发现,Bam H I可作为所有测试菌株PFGE指纹图谱分析的限制性内切酶。PFGE结果显示,40株菌株均显示出较好的PFGE多态性,其中来自同一家庭或同一医院的菌株具有较高的同源性,这说明C.upsaliensis可在一定区域内于宠物之间传播。5.对分离的C.upsaliensis菌株进行抗生素敏感测试条件摸索,显示采用Bolton马血肉汤进行最低抑菌浓度实验可得到较客观的结果。抗生素敏感测试结果显示,18株（45%）对氨苄西林耐药,17株（42.5%）对环丙沙星耐药,17株（42.5%）对萘啶酸耐药,17株（42.5%）同时具有环丙沙星和萘啶酸两种抗生素的耐药性,14株（35%）同时具有环丙沙星、萘啶酸和氨苄西林三种抗生素的耐药性,且部分菌株表现出高强度的耐药能力。所有菌株对阿奇霉素、氯霉素、红霉素、庆大霉素和四环素均敏感。6.C.upsaliensis和C.helveticus菌株表现出与空肠弯曲杆菌类似的对He La细胞的细胞膨胀致死毒性,该毒性可能源自cdt基因的表达,其中C.upsaliensis菌株之间具有明显的毒力差异。老鼠模型实验显示高毒性C.upsaliensis菌株可能具有更强的致病风险。7.通过中和实验验证C.upsaliensis CDT蛋白的毒性。重组Cdt B蛋白的诱导表达条件为:培养温度37℃、IPTG浓度0.01 m M、诱导时间为4 h。中和实验结果表明,C.upsaliensis的细胞毒性由其cdt基因表达,其cdt基因具备生物活性。Western blot结果表明,C.upsaliensis的CDT蛋白具有特异性。但是,CDT强毒性菌株OPU094C1的Cdt B表达并未出现明显的增高,因此,该菌株的高CDT毒性并非来自于Cdt B的高表达。本研究结果表明所建立的弯曲杆菌分离鉴定及检测方法为弯曲杆菌快速筛查提供了可靠的工具,通过流行病学调查发现猫狗宠物是C.upsaliensis和C.helveticus的常见宿主,所有分离的弯曲杆菌均具有CDT毒性,说明动物源弯曲杆菌对人存在潜在威胁,研究结果为弯曲杆菌综合防控提供了理论依据。