口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的牛、猪、羊等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，国际兽医局将其列为“A类烈性传染病”之首，一旦爆发，必须捕杀感染及接触感染的动物，不仅造成巨大的经济损失，而且严重危害畜牧业的发展。目前，大多数流行FMD的国家以疫苗免疫为主的措施预防FMD。然而，FMDV具有7个血清型且变异快，不同血清型疫苗之间没有交叉免疫保护反应，故通过疫苗单一手段很难控制和根除FMD，因此科学家们在注重疫苗研发的同时，开始关注病毒和宿主之间的关系，尤其是病毒受体在病毒感染过程中的作用，期望通过敲除或沉默病毒的关键受体阻断病毒的感染，进而达到控制和根除FMD的目的。研究表明，整联蛋白（Integrin) αvβ6是FMDV感染并致病的最重要的病毒受体，它可与所有血清型的FMDV结合。敲除整联蛋白通用亚基αv基因的转基因小鼠死胎率高、生长发育异常且易发生肿瘤，因此，αv基因不是抗FMD研究的理想受体基因；β6是启动FMDV强毒感染的决定性受体亚基，敲除整联蛋白β6亚基基因的转基因小鼠生长发育正常。因此，敲除整联蛋白β6亚基是阻断病毒感染的关键途径，为研制控制和根除FMD的药物提供靶点。传统的基因打靶效率低，周期长。因此，近年来人们不断尝试发现新的基因打靶技术并应用于基因研究中，其中，锌指核酸酶技术已经成为基因打靶的一个高效、有力的工具,可在细胞和个体水平上进行基因操作，并成功应用于多种动物的基因修饰。本研究采用手术方法取出45日龄的荷斯坦奶牛胎儿，利用胶原酶IV消化法，培养了原代奶牛胎儿成纤维细胞系，并对其F0及F1代进行了大量冻存，以备后续实验的使用。根据NCBI上公布的牛整合素β6基因序列设计引物，以实验室分离培养的原代奶牛胎儿成纤维细胞的DNA为模板，扩增β6基因，并进行测序，测序结果提交SIGMA公司，定制针对integrin β6亚基基因的锌指核酸酶。对电转染的程序进行优化，最终选择U-023作为电转染原代奶牛胎儿成纤维细胞的程序，ZFNs采用此程序电转染原代奶牛胎儿成纤维细胞，T-A克隆、DNA测序并与野生型序列进行比对，确定切割位点发生突变的细菌克隆数，突变数/送测总数就是ZFN针对靶DNA切割的打靶效率，约为22.9%，有限稀释法制备单克隆细胞，克隆环挑取细胞克隆并进行扩大培养，按打靶效率检测方法进行鉴定，获得阳性细胞克隆25个，其基因突变类型分为三种：基因的添加（2/25，8%）包含1个纯合子一个杂合子、敲除(17/25，68%)包含8个纯合子和9个杂合子及混合细胞克隆（6/25，24%）包含6个杂合子。针对ZFNs切割位点设计了含有无启动子的GFP基因的同源打靶载体pβ6LNGR，线性化同源打靶载体并与ZFNs共转染原代奶牛小肠上皮细胞，倒置荧光显微镜下观察到GFP的表达，初步验证ZFNs介导发生同源重组，单转线性化的pβ6LNGR质粒，未观察到GFP表达。随后两者共转染原代奶牛成纤维细胞，经G418筛选10天，挑取克隆，PCR方法进行鉴定，获得阳性细胞克隆10个，其中1个纯合子9个杂合子，初步验证ZFNs介导的同源打靶效率为3.6%，单转并未获得阳性克隆细胞。本研究为抗FMD的药物提供靶点，同时为FMD侵染机制研究及其它功能基因的插入奠定基础。