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研究目的:创建一步法多重荧光定量RT-PCR技术,能够同时检测流感病毒A型(Flu A)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒,并研究2014-2015年三例新型人感染HPAI-H5N6毒株的血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子生物学特征。研究方法:1.H5N6和国内外人和禽FluA的多条基因序列均从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库下载,利用Mega6.0软件确定各基因的保守区,采用Primer Express3.0软件设计高度特异性的引物和TaqMan探针,两者的特异性可通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行序列比对和验证。2.连接各目的DNA片段至载体pMDTM19-T Simple Vector上,然后转化DH5α感受态大肠并培养。选取经过基因测序和PCR鉴定后的阳性克隆菌株,提取质粒DNA,其浓度采用NanoDrop ND-2000核酸检测仪检测,确定目的基因片段DNA的拷贝数,并作为标准品的母液(1.0×108copies/mL)。根据实验要求,将标准品母液以倍比(10倍)稀释法连续稀释至最低浓度(102copies/mL),并置于-80℃保存。用本方法检测不同浓度目的基因标准品,连续检测3次,进行灵敏度与重复性分析。3.在本方法反应体系中加入本科室保存的十几种呼吸道病原微生物及HPAI-(H5N1、H5N6)和H7N9灭活病毒株,检测反应体系的特异性。4.采集2014年12月～2015年2月期间浙江大学医学院附属第一医院发热门诊135例流感样患者的咽拭子样本,并置于3.0mL的病毒运输培养液中,采用病毒RNA核酸提取试剂盒提取核酸,用本方法和上海之江生物科技股份有限公司提供的试剂盒分别检测,比较两者的符合率。5.序列比对、同源性分析和进化分析采用MEGA6.0软件。按照WHO推荐的方法进行进化树分析,其中HA基因用邻接法(neighbour-joining),NA基因用最大似然法(maximum likelihood),自展值为 1 000。6.采用MEGA6.0软件进行基因序列突变位点分析;NetNglyc服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)检查Asn-Xaa-Ser/Thr(其中Xaa代表除了脯氨酸之外的任何氨基酸)序列,对N-糖基化位点进行预测。研究结果:1.方法学灵敏度及重复性分析:用该法检测通过倍比(10倍)稀释的标准品,结果显示建立的方法对每个目的基因检测灵敏度均达1.0×102copies/mL。重复3次检测不同浓度的核酸,其各自检测的Ct值批内标准差在0.18～0.46之间,变异系数(CV)<5.00%,说明其批内重复性较好2.方法学特异性分析:对本科室保存的十几种菌毒株和由传染病诊治国家重点实验室提供的3种禽流感毒株的灭活物样本,分别采用上海之江生物科技股份有限公司提供的检测试剂盒和本文研究的多重荧光定量RT-PCR法进行检测,结果显示:该研究建立的多重荧光定量RT-PCR法检测结果与上海之江生物科技股份有限公司的检测结果完全一致,且该检测方法与其他呼吸道病原体均无交叉反应,表明其特异性达到了 100%。3.方法学符合率分析:检测发热门诊采集的流感样患者的咽拭子样本,其中阳性结果的目的基因的Ct值在19.35～32.58之间,所有例患者的RP基因均为阳性,样本中FluA阳性23例,未能检测到HPAI-H5N6病毒感染的阳性病例。本文研究的多重荧光定量RT-PCR检测试剂盒与上海之江生物科技股份有限公司提供的各亚型检测试剂盒的检测结果一致,符合率达100%。4.H5N6病毒HA基因推导的氨基酸同源性比较与系统发育树分析:3例感染HPAI-H5N6 患者毒株 A/Guangzhou/39715/2014(H5N6)(GZ/39715/14)、A/Yunnan/0127/2015(H5N6)(YN/0127/15)及A/Sichuan/26221/2014(H5N6)(SC/26221/14)HA基因推导的氨基酸之间的同源性为96.5%～98.7%。进化树分析显示3例感染HPAI-H5N6患者毒株处于两个不同的分支,其中GZ/39715/14和YN/0127/15与在老挝、广东、江西、浙江等地分离到的A/duck/Laos/XBY004/2014(H5N6)、A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)、A/chicken/Jiangxi/NCDZT1 126/2014(H5N6)、A/chicken/Zhejiang/727155/2014(H5N6)等亚洲禽类感染毒株处于同一分支,SC/26221/14与在四川、江西等地分离到的A/duck/Sichuan/NCJPL7/2014(H5N6)、A/duck/Jiangxi/13484/2014(H5N6)等中国境内禽类感染毒株处于另一分支;三株人感染HPAI-H5N6患者毒株HA基因来源于H5亚型中的2.3.4.4分支。5.H5N6病毒NA基因推导的氨基酸同源性比较与系统发育树分析3例感染HPAI-H5N6 患者毒株 GZ/39715/14、YN/0127/15 及 SC/26221/14NA 基因推导的氨基酸之间的同源性为90.1%～98.2%。进化树分析显示3例感染HPAI-H5N6患者毒株处于两个不同的分支,其中GZ/39715/14、YN/0127/15与在广东、浙江、江西、老挝等地分离到的 A/chicken/Shenzhen/2396/2013(H5N6)、A/duck/Zhej iang/727158/2014(H5N6)、A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014(H5N6)、A/duck/Laos/XBY004/2014(H5N6)等亚洲禽类感染毒株属于同一分支;SC/26221/14与在江西、浙江、广东等地检测到的A/duck/Jiangxi/13484/2014(H5N6)、A/goose/Zhejiang/1120132/2014(H5N6)、A/chicken/Shenzhen/1845/2013(H5N6)等中国境内禽类感染毒株属于同一分支;3例感染HPAI-H5N6患者毒株NA基因来源于H6N6病毒株。6.HA氨基酸序列突变位点分析:通过MEGA6.0软件分析,在第222-224位存在保守氨基酸序列QRG。同时部分毒株存在S137A和T160A突变,直接导致缺失158N-糖基化,两株HA的切割位点是PLRERRRKR/GLF,另一株切割位点是 PLREKRRKR/GLF。7.糖基化位点分析3例感染HPAI-H5N6患者的毒株HA均发现了 6个糖基化位点,其中YN/0127/15多一处Asn124(Asn:天冬酰胺)。8.H5N6病毒疫苗表位预测显示广东株HA蛋白中较有可能成为B细胞表面抗原表位区段为:26-30;99-103;110-113;136-142;169-173;181-184;197-200;235-239。四川株HA中较有可能成为B细胞表面抗原表位区段为:26-30;99-103;110-113;137-142;181-185;197-200;235-239。综合两株的表位结果,26-30;99-103;110-113;137-142;181-184;197-200;235-239 可作为 HPAI-H5N6 可能的线性 B细胞表位。研究结论:1.多重荧光定量RT-PCR技术是在普通PCR原有一对特异性引物上增加了一条特异性的荧光双标记探针。利用检测系统中荧光量的变化来判定结果,我们利用此原理建立了多重荧光RT-PCR法可以单管同时检测并区分甲型流感及HPAI-H5N6 病毒。2.通过多角度的分析,该方法稳定、快速、具有高灵敏度、高特异性及重复性好的特点,该方法对FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断有一定的临床价值。3.临床标本验证:利用我们建立的反应体系和之江提供的各亚型检测试剂盒检测临床病人标本,结果两者符合率达到了 100%。4.通过基因进化分析,我们发现新型人感染HPAI-H5N6病毒是一种重组病毒,其HA基因来源于H5亚型中的2.3.4.4分支,NA基因来源于H6N6病毒株。5.H5N6病毒HA基因位点突变及N-糖基化改变可能有助于增强其对人类的感染。6.H5N6 病毒疫苗表位预测:26-30;99-103;110-113;137-142;181-184;197-200;235-239可作为HPAI-H5N6可能的线性B细胞表位。可将以上抗原表位作为研制H5N6流感疫苗的依据,为下一步疫苗研究做准备,在H5N6流行中需重点观察该病毒在这些区域的变异情况。