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本项目旨在应用现代营养学、细胞系模型、蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR(RT-PCR)等技术手段,从细胞和分子水平探究Ala-Gln与仔猪小肠上皮细胞自噬之间的内在关系及阐明mTOR/p38MAPK信号通路在仔猪小肠上皮细胞自噬过程中的介导作用。研究结果将为揭示Ala-Gln调控仔猪小肠上皮细胞自噬的作用机制提供理论依据,并为Ala-Gln在仔猪饲料中的科学应用提供理论依据。试验一不同浓度Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞IPEC-1自噬的影响试验采用单因子设计,共设有6个处理,每个处理4个重复。在体外培养的各组IPEC-1细胞中分别添加终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM的Ala-Gln。采用MTT法制定IPEC-1细胞浓度标准曲线、生长曲线和检测细胞活力及待细胞生长到融合度到达80%-90%时收集细胞样品进行Western blot。结果表明:(1)所有添加Ala-Gln组的细胞生存率均极显著大于对照组(P<0.01),其中3.2mM水平添加组细胞生存率高于对照组51.08%(P<0.01);3.2mM水平添加组的细胞生存率极显著大于0.2mM、0.4mM水平组(P<0.01),显著大于0.8mM(P<0.05)(2)随着Ala-Gln添加量的增加,LC3-Ⅱ蛋白的表达量呈现先增后减的趋势,当添加量为1.6mM时LC3-Ⅱ蛋白的表达量达到最大值且极显著高于其他组(P<0.01)。同时随着Ala-Gln添加量的增加,p62蛋白表达量呈现逐渐降低的趋势,且各组间差异极显著(P<0.01)。由此可知,随着Ala-Gln添加量的增加,IPEC-1细胞的自噬逐渐增强。以上结果提示:Ala-Gln能在一定程度上提高IPEC-1细胞的生存率,同时Ala-Gln能够增强IPEC-1细胞的自噬。试验二Ala-Gln调节IPEC-1细胞自噬的mTOR和p38MAPK信号通路研究本试验以IPEC-1细胞为体外细胞模型,采用MTT法检测不同浓度mTOR和p38MAPK信号通路特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin RAPA)和SB203580对IPEC-1细胞活力的影响;然后采用Western blot方法检测添加特异性抑制剂后对mTOR和p38MAPK信号通路相关蛋白及自噬相关蛋白的影响,从而研究mTOR和p38MAPK信号通路介导Ala-Gln对仔猪小肠上皮细胞自噬的影响。结果显示,(1)添加0.11μM RAPA组与对照组之间的细胞活力无差异(P>0.05),随着RAPA添加量逐渐增加,细胞活力逐渐下降,且各组间差异极显著(P<0.01);随着SB203580添加水平的增加,IPEC-1细胞的活力逐渐降低,且各组之间差异极显著(P<0.01)。(2)添加1μM RAPA后,能显著性降低mTOR(P=0.024)、磷酸化mTOR(p-mTOR)(P=0.016)、p62(P<0.01)蛋白的表达量,能够极显著的增高LC3-Ⅱ蛋白的表达量(P<0.01);同时随着Ala-Gln浓度增加,mTOR、LC3-Ⅱ蛋白表达量极显著升高(P<0.01),p-mTOR、p62蛋白的表达量极显著降低(P<0.01);Ala-Gln与RAPA对LC3-Ⅱ、p62蛋白表达量的交互作用极显著(P<0.01),对p-mTOR蛋白表达量有显著的交互作用(P=0.012)。(3)添加40μM SB203580后,对p38MAPK、LC3-Ⅱ蛋白没有规律性作用,对磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)蛋白具有极显著的降低作用(P<0.01),能极显著的增加p62蛋白的表达量(P<0.01);随着Ala-Gln添加量的增加,p-p38MAPK、LC3-Ⅱ蛋白表达量极显著增加(P<0.01),p62蛋白的表达量极显著降低(P<0.01);Ala-Gln与SB203580对LC3-Ⅱ、p62的蛋白表达量分别有极显著交互作用(P<0.01)和显著性交互作用(P=0.034)。综上研究得出,mTOR和p38MAPK信号通路介导Ala-Gln对IPEC-1细胞自噬的影响,mTOR信号通路能够抑制IPEC-1细胞自噬的发生,p38MAPK信号通路可能促进IPEC-1细胞的自噬的发生。试验三Ala-Gln对IPEC-1细胞mTOR信号通路下游信号分子及其相关基因表达的影响采用单因子试验设计,共设6个处理,每个处理3个重复。在体外培养的各组IPEC-1细胞中分别添加终浓度为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM的Ala-Gln。运用Western blot、荧光定量PCR技术检测不同浓度Ala-Gln对mTOR信号通路的影响。结果表明:(1)在mTOR信号通路中,添加Ala-Gln后,p-mTOR蛋白的表达量极显著降低(P<0.01)。(2)添加Ala-Gln后,ATG13、ULK1的mRNA表达量均极显著提高(P<0.01),均随着Ala-Gln浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,且在Ala-Gln浓度为1.6mM时达到最大值。p53、Bax的mRNA表达量均极显著提高(P<0.01),且均随着Ala-Gln浓度的增加基本呈现逐渐增加的趋势。综上所述:添加Ala-Gln,能够抑制mTOR信号通路,上调mTOR下游信号分子ULK1、ATG13基因表达,同时上调与mTOR相关的p53、Bax基因表达,Ala-Gln通过对以上信号分子的综合作用,从而促进IPEC-1细胞自噬。