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本研究采用酵母双杂交技术,筛选胞红蛋白(Cytoglobin,CGB)相互作用分子,从人的胎脑cDNA文库中筛选鉴定了金属硫蛋白Ⅱ(MetallothioneinⅡ,MT2)为CGB的一个相互作用蛋白。并采用酵母回转,细胞内共定位实验验证该相互作用;同时,采用RT-PCR检测CGB在氧化损伤模型下的mRNA的水平变化,荧光显微镜观测CGB与MT2相互作用的共定位变化;并成功获得CGB的原核表达产物,为进一步深入探讨相互作用分子的生物学功能奠定了基础。本研究包含以下几方面内容。
1.胞红蛋白相互作用分子的筛选。构建了胞红蛋白酵母双杂交载体,确认CGB重组载体在酵母菌株AH109中成功表达且无自激活活性后,筛选人胎脑cDNA文库,共得到56个阳性克隆;对其进行PCR扩增后连接到pGEM-T载体上进行测序鉴定,共得到44个序列,生物信息学分析其中的一个克隆C71与MT2的序列完全一致。
2.胞红蛋白与金属硫蛋白Ⅱ相互作用的确认。采用酵母回转实验对上述筛选确定的CGB与MT2的相互作用进行验证,结果表明MT2自身不具有自激活活性,说明MT2与CGB在酵母内可以发生相互作用;COS7细胞内共定位实验结果显示,过表达CGB主要在胞浆分布,少量在胞核分布,MT2过表达在胞浆中分布,CGB和MT2共表达后二者存在共定位,一部分在胞浆点状共定位,一部分在胞核点状共定位。进一步证明了CGB与MT2在胞内确实可以相互作用,并且CGB可能具有募集MT2入核的功能。
3.CGB在氧化模型下的表达及与金属硫蛋白Ⅱ共定位的变化。通过RT-PCR实验检测CGB在ZnSO4模拟细胞氧化损伤时的表达变化,发现当ZnSO4浓度大于75μM处理时CGB表达量显著升高;100μM处理下6小时CGB的表达量已显著升高,12小时达到峰值而后下降,48小时CGB的表达量仍显著高于对照组。同时ZnSO4处理后,CGB与MT2共定位明显移位于胞核内,提示二者相互作用可能与氧化损伤导致的DNA损伤保护反应相关。
4.胞红蛋白表达产物的获得。成功构建胞红蛋白原核表达载体,并成功表达,获得大量有活性的胞红蛋白原核表达产物。
以上研究我们得出如下结论:首次发现胞红蛋白与金属蛋白Ⅱ存在相互作用;胞红蛋白与金属蛋白Ⅱ相互作用与机体氧化损伤应答密切相关。