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异源三聚体G蛋白是在所有真核生物细胞内保守的一类重要信号转导分子，通常所说的G蛋白是指异源三聚体G蛋白。在哺乳动物体内G蛋白发现了20多种α亚基、5种β亚基及12种γ亚基，它们能组成一千多种G蛋白。与动物细胞内的G蛋白形成鲜明的对比，植物G蛋白通常只有1种到5种，如拟南芥G蛋白包含一个α亚基(AtGPA1)，一个13亚基(AGB1)和三个γ亚基(AGGl，AGG2和AGG3)。对拟南芥Gα(GPA1)和Gβ(AGB1)的基因功能的研究表明G蛋白介导整个发育过程。
水稻G蛋白编码一个α亚基(RGA1)，一个β亚基(RGB1)和5个γ亚基(RGG1，RGG2，OsGGC2，GS3，qPE9-1)。在水稻中，RGA1的功能丧失引起严重的形态变化，如矮化，较宽的茎，短而宽的叶，直立的穗，小谷粒和由抑制引起的第二节间的不伸长，并且RGA1突变体对外源赤霉素不敏感。GS3和qPE9-1/DEP1是水稻产量的主效QTL。GS3主要调节籽粒大小并在幼穗中高度表达。qPE9-1/DEP1主要调节穗长并在大多数组织中表达，在水稻的花序分生组织中表达最高。DEP1以及GGC2正调控种子大小，并且他们的作用依赖于G蛋白α亚基以及D亚基。然而RGB1，RGG1，RGG2的功能缺失突变体还没有报道，并且目前G蛋白调控的植物生长发育的机制研究多集中在拟南芥上，而水稻G蛋白是如何调控生长发育的研究较少。
本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻G蛋白β亚基和γ亚基的所有成员进行定点敲除，为了保证研究背景的一致性，转基因受体亲本均选用水稻品种中花11，并用获得的突变体对其功能进行解析。主要研究结果如下:
一、水稻G蛋白β亚基RGB1功能缺失突变体鉴定及表型分析
1.通过CRISPR/Cas9系统构建双元载体p35S∷Cas9-RGB1，利用农杆菌介导的方法将表达载体转化中花11品种。To株系RGB1靶序列区测序结果表明，17个转基因株系中有6个株系目标基因被编辑，其中有一个株系为纯合突变体(-3bp)，其余均为杂合突变体。
对T1的所有存活幼苗的单株进行RGB1靶位点测序，只有-3bp和+3bp的纯合突变，其余均为野生型及RGB1杂合型突变。RGB1杂合型单株的花粉育性正常，且种子具有完整的胚芽和胚根。
2.对RGB1杂合型株系的种子进行发芽实验，结果发现无论是利用砂培(去壳的种子)还是水培(未去壳的种子)，均有一部分种子不能够正常发芽，表现为主根和叶片生长受到严重抑制。对这些不能够正常发芽的种子，分单粒提取基因组DNA并对RGB1靶序列进行测序分析，发现有三种目标基因编辑类型，分别被命名为rgb1-1(+1bp),rgb1-2(-bp)1bp)和RGB1-3(-11bp)。这三种突变体均表现出主根和叶片生长受到抑制，且苗期致死。
3.为了确定RGB1突变体致死的原因，分析了水稻胚后发育早期不同阶段的幼苗的生长情况。与对照相比，三种类型RGB1突变体在发芽后第一天停止生长。胚的解剖实验发现，发芽后48小时到96小时，RGB1-1突变体的胚根颜色从黄色变为褐色，然后变为深褐色，而野生型的胚根总是白色。愈伤诱导实验表明，与对照相比RGB1突变体成熟胚诱导的愈伤组织生长被抑制，尤其芽的伸长被显著抑制。将RGB1突变体与野生型愈伤的胚纵切，发现与野生型相比RGB1突变体胚根呈棕色。该结果表明RGB1是水稻幼苗发育和愈伤诱导的关键基因。
4.胚后发育早期检测RGB1的启动子活性和mRNA的表达特性，研究结果表明RGB1在发芽时期表达较弱，而随着幼苗的发育RGB1的表达逐渐增强，在胚的维管组织，根表皮和胚轴中特异表达。在根的发育过程中，RGB1mRNA在主根的后生木质部，不定根、侧根的起始，侧根的分生组织，主根成熟区的表皮及维管组织均有检测到。
5.对浸种1天、3天的野生型及发芽后1天、2天、3天的野生型及RGB1突变体幼苗的胚纵向切片进行分析，发现rgb1突变体胚根和胚轴的伸长受到抑制是因为其细胞生长的停止。
二、水稻G蛋白β亚基参与激素通路调控幼苗发育
1.选取野生型和rgb1-1突变体3日龄幼苗胚及部分侧生器官进行RNA-seq和qPCR验证以及植物内源激素含量测定实验。将野生型与rgb1-1转录组数据进行对比分析，结果表明共检测到9，743个差异表达基因，其中52.54％(5，119个)的基因表达下调，47.46％(4，624个)的基因表达上调。KEGG富集分析显示这些基因在苯丙烷类生物合成，DNA复制，二萜类生物合成，核糖体和植物激素信号转导中富集。与野生型相比，rgb1-1突变体中SAM，维管组织和根中特异性表达的基因大多数(81.8％)显著下调。在rgb1-1维管组织中，生长素转运基因PIN1A，PIN1B，PIN1C，PIN2和PIN3A，生长素响应基因OsARF11，OsARF16和OsARF19，以及细胞分裂素响应A型基因RR1，RR2，RR3，RR4，RR5，RR6和RR7表达下调，而细胞分裂素降解基因CKX4和CKX9的表达上调。在rgb1-1根中，BR途径中的GSK2，BAK1和BRH基因以及生长素响应基因IAA11，IAA13，IAA23和IAA24显著下调。
2.Pearson相关性检验显示qRT-PCR和RNA-seq数据之间存在强相关性(r=0.85;p＜0.05)，这证实了本研究中获得的RNA—seq结果的可靠性。除了验证RNA.seq结果外，还进一步研究了2日龄和3日龄幼苗中与生长素信号相关的基因的表达和生长素含量的变化。与2日龄幼苗中的野生型相比，RGB1突变体中OsARF4，OsARF9和OsARF13上调超过3倍，OsARF11和OsARF19在3日龄幼苗中下调超过3倍。在萌发后第3天，RGB1突变体与野生型相比，Os1AA2，Os1AA7，OsIAA1O，OsIAA13，OsIAA16，OsIAA17，OsIAA24，OsIAA26，OsIAA27的表达显著降低5倍以上。在RGB1突变体中，OsPIN1d，OsPIN2和OsPIN5C在2日龄和3日龄幼苗中均下调，并且在3日龄幼苗中下调超过30倍。
3.2日龄幼苗啦，突变体中的生长素含量显著低于野生型，但3日龄幼苗中的生长素含量显著高于野生型。除了生长素，还测量了RGB1突变体和对照中的细胞分裂素和油菜素内酯含量。在RGB1突变体3日龄幼苗中检测不到异戊烯基腺苷含量但在野生型中微量存在，并且RGB1突变体中油菜素内酯的含量是对照的10倍。这些结果表明RGB1突变后细胞内生长素、细胞分裂素和油菜素内酯含量均发生了变化，RGB1通过调节生长素、细胞分裂素和油菜素内酯的含量调节水稻幼苗的生长发育。
三、水稻Grs成员突变体鉴定及表型初步分析
1.通过水稻突变体CRISPR/Cas9系统构建双元载体p2×35S∷Cas9-RGG1，p2×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9-RGG1RGG2，p2×35S∷Cas9-GS3，p2×35S∷Cas9-qPE9-1，p2×35S∷Cas9-OsGGC2，利用农杆菌介导的方法将这些载体转化水稻品种中花11，分别获得了多个被编辑的转基因T0株系。
2.经过多代测序分析，在T1和T2分离出了RGG1、GS3、OsGGC2、qPE9-1功能缺失的纯合突变体单株，将rgg1突变体分别命名为rgg1-1(-7bp),rgg1-2(-2bp)rgg1-3(1SNP,-16bp)rgg1-4(+1bp);gs3突变体分别命名为gs3-1(-1bp)，gs3-2(-2bp)，gs3-3(-34bp)，gs3-4(+1bp);qpe9-1突变体分别命名为qpe9-1-1(-1bp)，qpe9-1-2(-2bp)，qpe9-1-3(-5bp)，qpe9-1-4(-7bp)，qpe9-1-5(+1bp);osggc2突变体命名为ggc2-1(-41bp)。
3.调查了rgg1，gs3，ggc2，qpe9-1突变体株系与对照中花11的农艺性状。结果显示不同类型的rgg1突变体株系的株高、穗长、剑叶长、剑叶宽和分蘖数与对照相比均没有显著差异，说明RGG1基因的功能缺失并不影响水稻在自然状态下的生长。而两个qpe9-1突变体株系株高变矮，剑叶长变短，穗长也显著变短，穗粒数没有显著的差异。说明qPE9-1不仅影响生殖生长，还影响营养生长。而ggc2突变体的株高与对照相比并没有显著差异，说明OsGGC2并不影响水稻的营养生长。
4.将以×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9-RGG1RGG2，T0和T1所有存活的单株幼苗提取基因组DNA，并对RGG1，RGG2靶序列区域进行测序分析，结果显示得不到纯合的突变体单株，所以认为rgg2单突变体及rgg1rgg2双突变体可能致死。
5.为了进一步研究rgg2单突和rgg1rgg2双突影响水稻生长的具体时期，本研究结合RGB1突变体表型特征，将p2×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9.RGG1RGG2杂合突变体株系种子做发芽实验。生长一周后发现，幼苗之间存在着明显的表型分离。RGG2单突杂合株系的幼苗中约25％的幼苗表现出苗的生长受到抑制，在叶枕处变褐色，根量减少。RGG1RGG2双突杂合株系的幼苗中约25％的幼苗根不能正常生长，叶片生长停止在4日龄期。将生长受抑制的幼苗提DNA并对RGG1及RGG2靶序列区域测序发现，RGG2单突变体与RGG1RGG2双突靶序列区域分别有碱基的插入或缺失，分离出了一种rgg2单突变基因型为:rgg2-1(-2bp);rgg1rgg2双突变体基因型分别为:rgg1rgg2-1(-7bp，+1bp)，rgg1rgg2-2(1bp SNIP-16bp，-1bp)，rgg1rgg2-3(+1bp，-1bp)，且rgg2和rgg1rgg2突变体苗期致死。
水稻G蛋白编码一个α亚基(RGA1)，一个β亚基(RGB1)和5个γ亚基(RGG1，RGG2，OsGGC2，GS3，qPE9-1)。在水稻中，RGA1的功能丧失引起严重的形态变化，如矮化，较宽的茎，短而宽的叶，直立的穗，小谷粒和由抑制引起的第二节间的不伸长，并且RGA1突变体对外源赤霉素不敏感。GS3和qPE9-1/DEP1是水稻产量的主效QTL。GS3主要调节籽粒大小并在幼穗中高度表达。qPE9-1/DEP1主要调节穗长并在大多数组织中表达，在水稻的花序分生组织中表达最高。DEP1以及GGC2正调控种子大小，并且他们的作用依赖于G蛋白α亚基以及D亚基。然而RGB1，RGG1，RGG2的功能缺失突变体还没有报道，并且目前G蛋白调控的植物生长发育的机制研究多集中在拟南芥上，而水稻G蛋白是如何调控生长发育的研究较少。
本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻G蛋白β亚基和γ亚基的所有成员进行定点敲除，为了保证研究背景的一致性，转基因受体亲本均选用水稻品种中花11，并用获得的突变体对其功能进行解析。主要研究结果如下:
一、水稻G蛋白β亚基RGB1功能缺失突变体鉴定及表型分析
1.通过CRISPR/Cas9系统构建双元载体p35S∷Cas9-RGB1，利用农杆菌介导的方法将表达载体转化中花11品种。To株系RGB1靶序列区测序结果表明，17个转基因株系中有6个株系目标基因被编辑，其中有一个株系为纯合突变体(-3bp)，其余均为杂合突变体。
对T1的所有存活幼苗的单株进行RGB1靶位点测序，只有-3bp和+3bp的纯合突变，其余均为野生型及RGB1杂合型突变。RGB1杂合型单株的花粉育性正常，且种子具有完整的胚芽和胚根。
2.对RGB1杂合型株系的种子进行发芽实验，结果发现无论是利用砂培(去壳的种子)还是水培(未去壳的种子)，均有一部分种子不能够正常发芽，表现为主根和叶片生长受到严重抑制。对这些不能够正常发芽的种子，分单粒提取基因组DNA并对RGB1靶序列进行测序分析，发现有三种目标基因编辑类型，分别被命名为rgb1-1(+1bp),rgb1-2(-bp)1bp)和RGB1-3(-11bp)。这三种突变体均表现出主根和叶片生长受到抑制，且苗期致死。
3.为了确定RGB1突变体致死的原因，分析了水稻胚后发育早期不同阶段的幼苗的生长情况。与对照相比，三种类型RGB1突变体在发芽后第一天停止生长。胚的解剖实验发现，发芽后48小时到96小时，RGB1-1突变体的胚根颜色从黄色变为褐色，然后变为深褐色，而野生型的胚根总是白色。愈伤诱导实验表明，与对照相比RGB1突变体成熟胚诱导的愈伤组织生长被抑制，尤其芽的伸长被显著抑制。将RGB1突变体与野生型愈伤的胚纵切，发现与野生型相比RGB1突变体胚根呈棕色。该结果表明RGB1是水稻幼苗发育和愈伤诱导的关键基因。
4.胚后发育早期检测RGB1的启动子活性和mRNA的表达特性，研究结果表明RGB1在发芽时期表达较弱，而随着幼苗的发育RGB1的表达逐渐增强，在胚的维管组织，根表皮和胚轴中特异表达。在根的发育过程中，RGB1mRNA在主根的后生木质部，不定根、侧根的起始，侧根的分生组织，主根成熟区的表皮及维管组织均有检测到。
5.对浸种1天、3天的野生型及发芽后1天、2天、3天的野生型及RGB1突变体幼苗的胚纵向切片进行分析，发现rgb1突变体胚根和胚轴的伸长受到抑制是因为其细胞生长的停止。
二、水稻G蛋白β亚基参与激素通路调控幼苗发育
1.选取野生型和rgb1-1突变体3日龄幼苗胚及部分侧生器官进行RNA-seq和qPCR验证以及植物内源激素含量测定实验。将野生型与rgb1-1转录组数据进行对比分析，结果表明共检测到9，743个差异表达基因，其中52.54％(5，119个)的基因表达下调，47.46％(4，624个)的基因表达上调。KEGG富集分析显示这些基因在苯丙烷类生物合成，DNA复制，二萜类生物合成，核糖体和植物激素信号转导中富集。与野生型相比，rgb1-1突变体中SAM，维管组织和根中特异性表达的基因大多数(81.8％)显著下调。在rgb1-1维管组织中，生长素转运基因PIN1A，PIN1B，PIN1C，PIN2和PIN3A，生长素响应基因OsARF11，OsARF16和OsARF19，以及细胞分裂素响应A型基因RR1，RR2，RR3，RR4，RR5，RR6和RR7表达下调，而细胞分裂素降解基因CKX4和CKX9的表达上调。在rgb1-1根中，BR途径中的GSK2，BAK1和BRH基因以及生长素响应基因IAA11，IAA13，IAA23和IAA24显著下调。
2.Pearson相关性检验显示qRT-PCR和RNA-seq数据之间存在强相关性(r=0.85;p＜0.05)，这证实了本研究中获得的RNA—seq结果的可靠性。除了验证RNA.seq结果外，还进一步研究了2日龄和3日龄幼苗中与生长素信号相关的基因的表达和生长素含量的变化。与2日龄幼苗中的野生型相比，RGB1突变体中OsARF4，OsARF9和OsARF13上调超过3倍，OsARF11和OsARF19在3日龄幼苗中下调超过3倍。在萌发后第3天，RGB1突变体与野生型相比，Os1AA2，Os1AA7，OsIAA1O，OsIAA13，OsIAA16，OsIAA17，OsIAA24，OsIAA26，OsIAA27的表达显著降低5倍以上。在RGB1突变体中，OsPIN1d，OsPIN2和OsPIN5C在2日龄和3日龄幼苗中均下调，并且在3日龄幼苗中下调超过30倍。
3.2日龄幼苗啦，突变体中的生长素含量显著低于野生型，但3日龄幼苗中的生长素含量显著高于野生型。除了生长素，还测量了RGB1突变体和对照中的细胞分裂素和油菜素内酯含量。在RGB1突变体3日龄幼苗中检测不到异戊烯基腺苷含量但在野生型中微量存在，并且RGB1突变体中油菜素内酯的含量是对照的10倍。这些结果表明RGB1突变后细胞内生长素、细胞分裂素和油菜素内酯含量均发生了变化，RGB1通过调节生长素、细胞分裂素和油菜素内酯的含量调节水稻幼苗的生长发育。
三、水稻Grs成员突变体鉴定及表型初步分析
1.通过水稻突变体CRISPR/Cas9系统构建双元载体p2×35S∷Cas9-RGG1，p2×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9-RGG1RGG2，p2×35S∷Cas9-GS3，p2×35S∷Cas9-qPE9-1，p2×35S∷Cas9-OsGGC2，利用农杆菌介导的方法将这些载体转化水稻品种中花11，分别获得了多个被编辑的转基因T0株系。
2.经过多代测序分析，在T1和T2分离出了RGG1、GS3、OsGGC2、qPE9-1功能缺失的纯合突变体单株，将rgg1突变体分别命名为rgg1-1(-7bp),rgg1-2(-2bp)rgg1-3(1SNP,-16bp)rgg1-4(+1bp);gs3突变体分别命名为gs3-1(-1bp)，gs3-2(-2bp)，gs3-3(-34bp)，gs3-4(+1bp);qpe9-1突变体分别命名为qpe9-1-1(-1bp)，qpe9-1-2(-2bp)，qpe9-1-3(-5bp)，qpe9-1-4(-7bp)，qpe9-1-5(+1bp);osggc2突变体命名为ggc2-1(-41bp)。
3.调查了rgg1，gs3，ggc2，qpe9-1突变体株系与对照中花11的农艺性状。结果显示不同类型的rgg1突变体株系的株高、穗长、剑叶长、剑叶宽和分蘖数与对照相比均没有显著差异，说明RGG1基因的功能缺失并不影响水稻在自然状态下的生长。而两个qpe9-1突变体株系株高变矮，剑叶长变短，穗长也显著变短，穗粒数没有显著的差异。说明qPE9-1不仅影响生殖生长，还影响营养生长。而ggc2突变体的株高与对照相比并没有显著差异，说明OsGGC2并不影响水稻的营养生长。
4.将以×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9-RGG1RGG2，T0和T1所有存活的单株幼苗提取基因组DNA，并对RGG1，RGG2靶序列区域进行测序分析，结果显示得不到纯合的突变体单株，所以认为rgg2单突变体及rgg1rgg2双突变体可能致死。
5.为了进一步研究rgg2单突和rgg1rgg2双突影响水稻生长的具体时期，本研究结合RGB1突变体表型特征，将p2×35S∷Cas9-RGG2，p2×35S∷Cas9.RGG1RGG2杂合突变体株系种子做发芽实验。生长一周后发现，幼苗之间存在着明显的表型分离。RGG2单突杂合株系的幼苗中约25％的幼苗表现出苗的生长受到抑制，在叶枕处变褐色，根量减少。RGG1RGG2双突杂合株系的幼苗中约25％的幼苗根不能正常生长，叶片生长停止在4日龄期。将生长受抑制的幼苗提DNA并对RGG1及RGG2靶序列区域测序发现，RGG2单突变体与RGG1RGG2双突靶序列区域分别有碱基的插入或缺失，分离出了一种rgg2单突变基因型为:rgg2-1(-2bp);rgg1rgg2双突变体基因型分别为:rgg1rgg2-1(-7bp，+1bp)，rgg1rgg2-2(1bp SNIP-16bp，-1bp)，rgg1rgg2-3(+1bp，-1bp)，且rgg2和rgg1rgg2突变体苗期致死。