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目的:课题组前期研究已获得美洲大蠊抗肝纤维化活性部位的提取纯化工艺,但提取率较低。本课题以美洲大蠊粗提物为原料,采用酶解技术拟制备高得率、高活性的美洲大蠊抗肝纤维化活性组分,为美洲大蠊抗肝纤维化的后续研究奠定基础。方法:1.蛋白酶的筛选采用福林酚法和BCA法测定美洲大蠊粗提物中的蛋白质含量。以美洲大蠊粗提物的水解度、各洗脱组分得率和对大鼠肝星状细胞（HSC-T6）抑制率为评价指标,同时以原工艺作为对照,评价胰蛋白酶（Trypsin,TR）,胃蛋白酶（Pepsin,PE）,碱性蛋白酶（Alkaline,AL）,木瓜蛋白酶（Papain,PA）,中性蛋白酶（Neutral Protease,NE）对美洲大蠊粗提物的酶解效果。采用N-三（羟甲基）甲基甘氨酸-十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Tricine-SDS-PAGE）检测不同蛋白酶酶解前后美洲大蠊粗提物分子量变化。2.中性蛋白酶和木瓜蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分的工艺优化以水解度、活性组分得率和体外活性为评价指标,在单因素考察（酶用量、酶解时间、pH值、酶解温度、底物浓度）的基础上,采用L9（34）正交实验优化中性蛋白酶和木瓜蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分的工艺。结果:1.蛋白酶的筛选美洲大蠊粗提物中蛋白质含量在45%以上,适于用酶解方法制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分。不同蛋白酶对美洲大蠊粗提物的水解度为:NE>PA>AL>TR>PE。以D组分的得率为评价指标,结果显示:PA>NE>AL>原工艺>PE>TR,PA、NE、AL酶解所得D组分的得率,与原工艺相比分别提高了30.36%、16.07%、14.29%。与原工艺相比,不同蛋白酶酶解后所得A、B、C组分对HSC-T6抑制作用无明显提高,但经TR、AL、NE、PA酶解得到的D组分（活性组分）在24,48,72h对HSC-T6细胞抑制的IC50值相对较小。不同蛋白酶酶解美洲大蠊粗提物前后分子量变化结果显示:美洲大蠊粗提物的分子量主要分布在16-45KDa之间,经不同蛋白酶酶解后,分子量降低。2.中性蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分的工艺优化结果表明:水解度与活性组分得率相关性较差,因此主要根据活性组分得率和体外活性确定最佳酶解条件。单因素实验和正交实验结果表明,各因素对活性组分得率影响为:酶用量>酶解pH值>酶解温度>酶解时间,对其体外活性影响为:酶用量>酶解pH值>酶解时间>酶解温度。确定中性蛋白酶最佳酶解工艺为:酶用量0.3%,酶解时间2h,pH值8.5,酶解温度45℃,底物密度1.07。对此工艺进行验证,得美洲大蠊粗提物水解度为15.8%;活性组分得率均值为0.72%,RSD为2.8%;相比原工艺（0.54%）,活性组分提高率为33.33%。原工艺所得活性组分24,48,72 h的IC50值为122.10μg·mL-1,122.1μg·mL-1,109.81μg·mL-1;验证所得活性组分24,48,72 h的IC50值在116.02-122.77μg·mL-1,111.75-117.57μg·mL-1,99.62-113.91μg·mL-1之间;相比原工艺,IC50有所降低,且具有显著性差异（P<0.05）。3.木瓜蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分工艺优化单因素实验和正交实验优化木瓜蛋白酶制备活性组分的酶解工艺为:酶用量0.6%,酶解pH值7.0,酶解时间1 h,酶解温度55℃。对此工艺进行验证,美洲大蠊粗提物水解度为11.49%;活性组分得率均值为0.70%,RSD为2.2%;相比原工艺（0.53%）,活性组分提高率为32.16%。原工艺所得活性组分24,48,72 h的IC50值为123.66μg·mL-1,113.46μg·mL-1,108.11μg·mL-1;验证所得活性组分24,48,72 h的IC50值在114.41-118.54μg·mL-1,104.46-114.29μg·mL-1,105.85-107.05μg·mL-1之间;相比原工艺,体外活性无显著性差异（P>0.05）。结论:以水解度、活性组分得率及体外活性为评价指标,筛选出制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分的最佳蛋白酶,并得到中性蛋白酶和木瓜蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分的最佳工艺。综合考虑成本问题,中性蛋白酶较木瓜蛋白酶制备美洲大蠊抗肝纤维化活性组分更佳。