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研究背景和研究目的:肝癌在中国的发病率在所有恶性肿瘤中位居第三位,死亡率位居第二位。对于直径小于5cm的肝癌,影像引导下的射频消融治疗(Radiofrequency ablation,RFA)后的1年、3年、5年生存率与肝癌切除术无显著差异,已成为和外科手术切除相媲美的肝癌治疗手段。在临床工作中,我们发现部分肝癌病人接受射频消融治疗后,在短期内复发并进展迅速,这可能与肿瘤的不完全消融有关,但具体机制尚不明确。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)在肿瘤的(包括肝癌)发生发展中扮演着至关重要的角色。上皮间质转化可促进肿瘤细胞增殖、迁徙、转移,最终导致肿瘤的进展。根据上述背景,本课题组应用小鼠的肝癌细胞系H22体外培养并模拟相对低温的不完全消融,建立小鼠同种原位移植肝癌模型并进行不完全性射频消融,从细胞和动物水平探讨不完全消融后肿瘤的复发和进展的可能机制。研究方法:1.小鼠肝癌细胞系H22体外模拟不完全消融1.1将对数生长期的H22细胞系沉浸于45℃水浴锅中加热5min,分别应用RT-PCR 及 Western Blot 检测处理前后 E-cadherin、Vimentin、Snail 的 mRNA 及蛋白的表达水平变化,以及磷酸化STAT3的表达变化;同时应用Elisa法检测处理前后培养上清中IL-6的表达水平变化。1.2应用Western Blot检测加入外源性IL-6前后及加入外源性IL-6并联合体外模拟不完全消融前后,E-cadherin、Vimentin、Snail、磷酸化STAT3蛋白的表达水平变化。1.3应用Western Blot检测加入外源性AG490前后及加入外源性AG490并联合体外模拟不完全消融前后,E-cadherin、Vimentin、Snail、磷酸化STAT3蛋白的表达水平变化。2.建立小鼠同种原位肝癌移植模型及不完全热消融模型1x106个H22细胞皮下注射Balb/c雄性小鼠右下肢,皮下瘤长成后,切成直径约1mm3的瘤块种植到小鼠肝脏,共建模10只。1周后开腹直视观察记录原位移植肝癌生长情况,随机选取5只小鼠进行45℃C,RFA消融5min处理,作为实验组,剩余5只作为对照组。术后观察小鼠生存情况,1周后处死解剖。应用Western blot、免疫组化分别检测复发肿瘤与原位移植肝癌E-cadherin、Vimentin、Snail、磷酸化STAT3蛋白的表达水平变化。研究结果:1.对小鼠肝癌细胞系H22进行体外模拟不完全消融后,与消融前相比,上皮标志物E-cadherin表达下降,间质标志物Vimentin表达升高,同时转录调控因子Snail和磷酸化STAT3蛋白表达升高。体外模拟不完全消融的细胞培养上清中,Elisa测得IL-6表达量较消融前升高。2.加入外源性IL-6处理H22细胞系后,与处理前相比,上皮标志物E-cadherin表达下降,间质标志物Vimentin表达升高,Snail和磷酸化STAT3蛋白表达量升高。且联合体外模拟不完全消融后,与不完全消融前相比,各指标之间仍呈上述变化且差异更加显著。3.外源性加入AG490处理H22细胞系后,与处理前相比,上皮标志物E-cadherin、间质标志物Vimentin、Snail和磷酸化STAT3蛋白表达无明显差异;AG490处理并进行不完全消融前后与单纯不完全消融前后相比,上皮标志物E-cadherin表达降低程度小于后者,同时间质标志物Vimentin、转录调控因子Snail和磷酸化STAT3蛋白表达升高程度小于后者。4.本次研究共建立10只小鼠同种原位移植肝癌模型,建模成功率100%。实验组消融术后1周,5只小鼠均可见明显大量腹水体征,同时解剖可见在射频瘤灶边缘肿瘤复发、进展。同时,与对照组相比,E-cadherin表达下降,Vimentin、Snail以及磷酸化STAT3表达升高。结论及意义:不完全消融可导致肿瘤的复发和进展,其机制可能是通过IL-6/STAT3/Snail信号通路诱导了 EMT的发生。阻断IL-6/STAT3/Snail信号通路可以有效的降低不完全消融带来的EMT的发生,这可能是抑制肝癌射频消融术后复发潜在的一种治疗手段。