论文部分内容阅读
第一部分h OGG1基因Ser326Cys位点多态性与糖尿病患者冠脉病变的对照研究目的了解糖尿病患者h OGG1基因Ser326Cys位点多态性与冠脉病变之间的关系。方法入选行冠状动脉造影术的糖尿病患者共323例,应用PCR-RFLP技术检测每位患者的h OGG1基因Ser326Cys位点多态性。同时检测患者血糖、血脂、肾功能等生化指标。根据患者h OGG1基因Ser326Cys多态性分为3组:Cys/Cys基因型组(85例)、Ser/Ser基因型组(117例)和Ser/Cys基因型组(121例)。由两名心血管医师对冠脉造影图像进行分析,按评判标准统计冠脉病变支数、病变复杂程度及Gensini评分和SYNTAX评分。分析h OGG1基因Ser326Cys多态性对h OGG1 m RNA表达和血8-OHd G水平的影响,以及这种影响对冠脉病变产生的结果。结果1.Cys/Cys基因型8-Ohd G水平高于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,而h OGG1m RNA水平低于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,差异有统计学意义(P<0.05);而Ser/Ser基因型与Ser/Cys基因型两者比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.Cys/Cys基因型出现三支病变的概率最高,Ser/Ser基因型出现单支病变的概率最高,但三组之间在冠脉受累支数方面差异均无统计学意义(P>0.05)。3.Cys/Cys基因型的Gensini评分和SYNTAX评分和冠脉复杂病变概率均高于Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型,差异有统计学意义(P<0.05)。而Ser/Ser基因型和Ser/Cys基因型之间比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论h OGG1基因Ser326Cys位点多态性与糖尿病患者冠脉病变有明显的关系,其中Cys/Cys基因型的冠脉病变可能更为严重。其机制可能为Cys/Cys基因型的h OGG1表达水平下降,识别和切除DNA双链中的8-OHd G能力降低,修复DNA氧化损伤的能力下降,从而加速动脉粥样硬化的发生、发展。第二部分高血糖诱导VECs氧化应激及线粒DNA损伤的研究目的研究高血糖对HUVECs的氧化应激及细胞mt DNA损伤方法将HUVECs置于含有30mmol/L D-葡萄糖的DMEM完全培养基中进行培养,分别在高糖培养前及培养后的12h,24h,48h用倒置荧光显微镜观察HUVECs形态。同时,在上述各时间点检测细胞内ROS、8-OHd G及h OGG1 m RNA的表达水平,并检测HUVECs的DNA及mt DNA的损伤情况。结果1.在高血糖状态下,HUVECs随着暴露时间的延长,细胞变得明显稀疏,体积增大,细胞轮廓逐渐变得不清晰。细胞的胞质界限不清且胞核大小不等,染色变淡。2.在高血糖状态下,HUVECs内8-OHd G、ROS水平随时间的延长逐渐增高,显示HUVECs的DNA、mt DNA损伤情况也逐渐加重。同时细胞内的h OGG1表达水平增加。3.在高血糖状态下,虽然HUVECs氧化修复过程强化,但与氧化损伤水平相比,h OGG1/ROS比值仍表现下降的特点。结论高血糖状态下,HUVECs内8-OHd G、ROS水平随暴露时间的延长逐渐增高,同时细胞内的氧化修复过程的增强,表现在h OGG1表达水平增加。但在高血糖状态下细胞内自身修复能力仍低于细胞氧化损伤程度,导致细胞发生形态、功能的改变。第三部分线粒体内h OGG1基因过表达对高糖诱导的VECs氧化应激损伤修复的研究实验一腺病毒介导转染的线粒体内h OGG1基因过表达HUVECs的构建与鉴定目的应用分子生物学技术构建线粒体内h OGG1基因过表达的HUVECs以供进一步的研究。方法分以下四步进行:1.含有线粒体靶向序列的MTS-h OGG1基因PCR扩增。2.质粒载体p ENTRTM3C和目的基因MTS-h OGG1的连接。质粒载体p ENTRTM3C和目的基因MTS-h OGG1建立酶切体系,连接建立重组质粒。p ENTRTM3C-MTS-h OGG1行基因测序、双酶切及PCR鉴定成功与否。3.重组质粒与腺病毒载体进行同源重组。取重组质粒p ENTRTM3C-MTSh OGG1和腺病毒载体p Ad/CMV/V5-DEST进行重组,筛选所得到的阳性克隆子,进行PCR鉴定。4.分别在HUVECS培养皿中分别加入重组腺病毒p Ad/CMV/V5-DESTMTS-h OGG1和空白腺病毒p Ad/CMV/V5-GW/lac Z,并与单纯的HUVECs作为对照。培养48h后,采用Westem blot法检测三组HUVECs的MTS-h OGG1表达情况。结果1.以pc DNA3.1(+)-MTS-h OGG1质粒为模板进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳,得到与插入目的片段大小一致的1200bp的电泳条带,证明质粒重组成功。2.重组质粒p ENTRTM3C-MTS-h OGG1的构建。经测序检测和插入目的片段一致,并经Bam H I和Xho I双酶切后,琼脂糖电泳出现一条2200bp和一条1200bp的两条条带,其中2200bp条带为原质粒p ENTRTM3C的线性片段,1200bp的为插入片段。证实成功构建重组质p ENTRTM3C-MTs-h OGG1。3.重组腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1转染的HUVECs、腺病毒载体Pad/CMV/V5-GW/lac Z转染的HUVECs细胞及HUVECs的h OGG1/β-actin分别为1.02±0.12,0.51±0.08,0.53±0.07。经统计学分析证实重组腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1转染的HUVECs线粒体内h OGG1基因过表达构建成功。结论应用分子生物学技术利用腺病毒载体p Ad/CMV/V5-DEST可以成功构建线粒体h OGG1基因过表达HUVECs。实验二线粒体h OGG1基因过表达对高糖诱导的VECs氧化应激损伤修复的研究目的研究线粒体h OGG1基因过表达对高糖诱导的HUVECs氧化应激损伤修复的影响。方法分别取重组腺病毒Pad-CMV5-DEST-MTS-HOGG1转染的HUVECs(目的基因组)、腺病毒载体Pad/CMV/V5-GW/lac Z转染的HUVECs细胞(空白基因组)及HUVECs(空白对照组)同时置于含30mmol/L的D-葡萄糖的DMEM完全培养基进行培养,并分别于高糖培养前及后12h、24h、48h分别检测HUVECs细胞内ROS、8-OHd G及线粒体膜电位变化,同时检测HUVECs的DNA的损伤情况。结果1.随着HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基培养时间延长,三组HUVECs产生ROS、8-OHd G的含量逐渐增强(p<0.05)。在相同时间点,目的基因组的HUVECs之间产生的ROS、8-OHd G含量低于空白基因组和空白对照组(p<0.05),而空白基因组与空白对照组间未见统计学差异(p>0.05)。2.各组HUVECs在含30mmol/L葡萄糖的DMEM完全培养基培养前及培养后12h,24h,48h后分别行JC-1荧光染色后流式细胞仪检测,其中目的基因组红色荧光与绿色荧光平均荧光强度比值最高(p<0.05);而空白基因组和空白对照组红色荧光与绿色荧光平均荧光强度比值明显下降(p<0.05)。而空白基因转染组和空白对照组之间未见明显差异(p>0.05)。结论线粒体h OGG1基因过表达对高糖诱导的HUVECs氧化应激损伤具有修复作用。