研究背景和目的:胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是一种最常见且最具侵袭性的脑肿瘤。目前对于胶质母细胞瘤并没有很好的医治手段,确诊后的中位生存期仅有12-15个月,且通常会复发。治疗胶质母细胞瘤应用最为广泛的化疗药物是替莫唑胺,但治疗效果欠佳。近年来,靶向药物广泛地应用于肿瘤治疗,在治疗早期可以得到很好的效果,但是长期服药的过程中病人逐渐产生耐药性,靶向药物也逐渐丧失其治疗效果。我们推测其根本原因在于肿瘤的发生发展是由多条信号通路异常激活共同介导的,而靶向药物仅靶向抑制了其中某一通路,其它激活的通路会继续促进肿瘤的发展,导致耐药性的产生。因此需要对GBM发生发展中各种活化信号通路之间的相互关系进行深入研究以寻求更高效的多靶点治疗方案。然而目前用于机制研究的GBM动物模型通常是由单一癌基因突变所诱导的肿瘤模型,虽然能够较好地模拟临床病人肿瘤的病理特征,但大大限制了对GBM发展机制的深入研究和多靶点治疗药物的研发。因此需要建立一个更加还原临床病人GBM发生发展机制的多信号通路介导的动物模型,来解决这些科学问题。此外,GBM的发生发展是否仅依赖于某一单一的癌基因突变仍缺乏有力证据,而从单一癌基因突变诱导的GBM动物模型中所能得到的结论仅能片面地反映对该癌基因通路的依赖性,无法考虑到其它癌基因/信号通路活化参与的可能性。那么GBM细胞的增殖是否依赖着某一个特定的癌基因?如果抑制起始肿瘤发生的癌基因/信号通路的活化,其它癌基因的激活是否能够继续维持GBM的恶性增殖?为了回答这些科学问题,本课题利用由Ras癌基因突变诱发的小鼠GBM模型,模拟人类GBM细胞中多个癌基因同时发生突变的状态,在GBM发展中抑制Ras癌基因的表达,同时激活其它增殖相关的信号通路后检测GBM的发展趋势,来探究GBM细胞对某一癌基因突变或信号通路是否具有单一依赖性。研究方法:制备过表达Hras敲低p53的Hras-shp53慢病毒,通过原位注射方法建立小鼠的GBM肿瘤模型;将成瘤的脑组织进行HE染色分析和免疫组化标志物鉴定;利用Tet-on系统构建可控制型Hras过表达质粒Tet-Hras-shp53,包装慢病毒后进行原位注射,小鼠给予多西环素处理诱导Ras过表达而产生GBM;提取诱导型原发胶质瘤细胞(Tet-GBM),进行体外培养,研究停药多西环素关闭Ras通路后肿瘤细胞的增殖情况;体外培养的肿瘤细胞,在关闭Ras通路的同时给予肿瘤细胞其它癌基因的激活,如C-Myc或SmoA1,探究转入C-Myc或SmoA1的GBM肿瘤细胞是否能够继续维持肿瘤细胞的增殖;将过表达C-Myc或SmoA1的GBM肿瘤细胞在关闭Ras通路后,分别进行SCID小鼠原位移植,观察小鼠成瘤情况以及生存曲线分析。研究结果将Hras-shp53慢病毒进行小鼠侧脑室注射,约一个月左右会形成肿瘤,成瘤率较高(约为100%);成瘤的小鼠大脑组织进行HE染色和免疫组化的验证,HE染色特点(核浆比例的增加、血管周围浸润性、出血、凋亡区域、多核巨细胞等)和免疫组化标志物的高表达(Flag、Ki67、Nestin、GFAP、βⅢ-tubulin、Vimentin)都符合恶性胶质瘤的特征,证明该肿瘤为胶质母细胞瘤(GBM);在Tet-GBM组织中提取出肿瘤细胞进行体外培养,随着停药时间的延长,Ras-AKT通路逐渐失活,肿瘤细胞的增殖开始减慢,而未停药组,肿瘤细胞则一直处于增殖的状态;Tet-GBM肿瘤细胞在Ras通路活化的同时转入C-Myc或SmoA1癌基因,关闭Ras通路后GBM细胞能够继续维持恶性增殖状态;SCID小鼠原位移植实验结果显示,在关闭Ras通路后,其它癌基因C-Myc或SmoA1也可维持GBM细胞的成瘤能力。研究结论:我们成功建立了可控型Ras癌基因突变诱导的小鼠胶质瘤模型,并且发现由Ras突变形成的GBM在停止Ras表达一定时间后,肿瘤细胞即无法维持增殖状态。而在这些肿瘤细胞中停止Ras表达的同时激活其它信号通路,结果发现无论转C-Myc还是SmoA1都能够维持GBM细胞的增殖状态。这就表明由Ras癌基因突变引起的GBM,如果仅存在Ras介导的信号通路活化,肿瘤细胞的增殖受Ras基因表达的控制。而当肿瘤细胞中存在其它增殖相关的信号通路活化的情况下,Ras基因的沉默将不会停止肿瘤的增殖,其它信号通路的活化则可以在Ras基因沉默后继续维持由Ras基因突变诱发的肿瘤细胞的增殖。我们的动物模型和实验结果提示着,GBM乃至于其它由多条信号通路诱发的肿瘤发展并非仅仅依赖着某单一的细胞信号通路。我们的研究为探索肿瘤细胞“癌突变依赖性”提供了新的思路,也为临床肿瘤治疗包括GBM采用多靶点联合用药提供了理论依据和实验数据。