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深海占地球表面积的49%,是地球表面最大的生物栖息场所,深海环境中(微)生物基因资源的开发具有现实、重要的资源及科学价值。典型深海特征为低温(<5℃)和高压(最高达110 Mpa),据估计在此极端条件下,深海环境中可培养微生物还不到0.01%,采用宏基因组技术能部分克服培养方法产生的偏差,获得新的科学发现和基因资源。
本论文采用富集方法构建了3个深海沉积物来源宏基因组文库,并对3个深海沉积物富集宏基因组文库及课题组前期构建的两个深海环境宏基因组文库克隆子发酵代谢产物进行了抗肿瘤(细胞毒)、抗菌、抗病毒活性的功能性筛选。
文库克隆子的化学多样性分析表明深海环境宏基因组文库克隆子发酵产物以大肠杆菌本底为主。对两个深海环境宏基因组文库克隆子发酵产物的生物活性筛选发现了几个具有抗肿瘤(细胞毒)活性的混合克隆和三个具有一定抗流感病毒活性的单克隆。
在3个深海沉积物富集宏基因组文库中发现了16个产颜色的克隆子,这些克隆子发酵产物具有抗真菌和/或抗肿瘤(细胞毒)活性。从其中两个克隆子5C11和11F6中分离鉴定出6个环二肽化合物和三个吲哚类化合物,其中一个为新结构的(2-羟基苯基)(二-1H-吲哚-3-基)乙酸,该化合物具有良好的细胞毒活性,对三种肿瘤细胞株的IC50约25μg/ml。
通过对其中10个产颜色克隆子的全长测序,发现了一个与芳烃降解相关的功能基因簇及两个与酚类降解相关的功能基因簇。转座子突变及HPLC指纹图谱和细胞毒活性测定结果表明,这些功能基因簇与克隆子次生代谢产物的细胞毒活性密切相关。克隆子全长序列分析及转座子突变结果发现了两个与黑色素产生密切相关的4HPPD酶,一个尿黑酸代谢途径完整功能基因簇及一个与色氨酸代谢相关的单加氧酶。
我们的研究提示对深海样品进行特定类群微生物预富集的方法具有一定的方法学意义,可显著提高生物活性克隆子的筛选阳性率,从目前的小于1/105文库克隆子提高到大于1/103文库克隆子。