淀粉样蛋白纤维(Amyloids)是一类错误折叠引发疾病的蛋白聚集体。近年来人们在细菌、真菌、蛛形钢动物、鱼和哺乳动物中发现了功能淀粉样蛋白纤维。Curli是一种典型的功能淀粉样纤维;在生物膜形成过程中，Curli是细胞外基质重要的组成部分，且具有调节细胞表面的吸附能力、细胞间相互作用和稳定三维结构、促使成熟的生物膜形成等重要功能。此外，Curli与一系列淀粉样疾病相关，如阿尔兹海默病(Alzheimer disease，AD)，帕金森病(Parkinsons disease，PD)，2型糖尿病(Type-2 diabetes)和肾功能衰竭等。　　Curli是由富含β-折叠的高度有序蛋白亚基胞外聚集，形成4-7 nm宽无分支细长的一类具有功能的淀粉样蛋白。Curli是由CsgA和CsgB两种亚基组成，且每种亚基都含有5个重复的谷氨酸和天冬氨模体，均表现出淀粉样蛋白的生化特征。CsgE和CsgF是Curli分泌途径中两个重要的分子伴侣，周质空间的CsgE直接与CsgA相互作用防止其在周质空间过早聚集，在细胞外膜上的CsgF参与CsgB调控CsgA的聚合。CsgG蛋白是Curli分泌途径中镶嵌在外膜上的膜蛋白，与Curli亚基CsgA等转运至胞外密切相关。本研究以革兰氏阴性菌大肠杆菌CFT073为材料，以其基因组DNA为模板，通过分子克隆手段，克隆出Curli分泌途径中重要的三个基因:csgF、csgE、csgG;通过生物信息学分析三个基因，构建不同的重组质粒，研究其表达水平;通过研究CsgF、CsgE、CsgG三种蛋白的纯化条件，获取高纯化和稳定的蛋白表达纯化条件;通过蛋白结晶条件的研究，获得蛋白晶体并进行数据分析;通过蛋白的互作功能研究，获得蛋白之间功能关系。主要的研究结果如下:　　1、Curli分泌系统中关键基因csgF的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础，成功构建了csgF重组表达质粒:pET-28a-CsgF-Full-C-6His、pET-28a-CsgF-nsp-N-6His、pET-28a-CsgF-nsp-C-6His、pET-28a-CsgF-(20-129)-C-6His;通过诱导条件优化，CsgF蛋白表达条件为:18℃、0.1 mmol/L IPTG诱导16-20 h;通过构建CsgF(20-129)截短体和纯化条件优化，CsgF(20-129)截短体稳定存在条件为:50 mmol/L醋酸钠、150 mmol/L NaCl、5％ Glycerol。　　2、Curli分泌系统中关键基因csgE的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础，成功构建了CsgE重组表达质粒成功的构建了pET-22b-CsgE-C-6His;通过诱导条件优化，CsgE蛋白表达在18℃、0.1 mmol/L IPTG、诱导16-20 h条件下，成功使csgE基因在周质空间获得表达;通过对CsgE重组蛋白的纯化及条件优化，最后在25mmol/L Tris-HCl、pH7.0、150 mmol/L NaCl、5％glyercol中获得了稳定的高纯化的CsgE蛋白。　　3、Curli分泌系统中关键基因csgG的克隆、表达和纯化。以生物信息学为基础，成功的将csgG基因克隆在pQLink-N表达载体上，获得了pQLink-N-CsgG-6His重组质粒;CsgG蛋白表达在18℃、0.1mmol/L IPTG、诱导16-20 h条件下获得表达;通过对CsgE重组蛋白的纯化及条件优化，最后在Buffer:25mmol/L Tris-HCl，pH7.0、150 mmol/L NaCl、5％glyercol、0.06％ LDAO获得了稳定高纯化的CsgG蛋白。　　4、CsgF、CsgE蛋白结晶分析及数据处理。开展了CsgF、CsgE蛋白晶体生长条件的筛选，成功的到了CsgE蛋白的晶体，CsgF未能获得晶体;通过对CsgE蛋白晶体的优化，最后在0.1 mol/L Imidazole、pH6.7、19.5％ PEG6000条件下获得了大的菱形晶体;在上海同步辐射中心(SSFR)对CsgE蛋白晶体进行X-Ray衍射，获得了1套分辨率为2.3(A)的X-Ray数据;通过在线数据处理软件分析，确定CsgE蛋白晶体的空间群为:P42212，晶胞参数:a=72.992; b=72.992;c=81.279。　　5、CsgF、CsgE和CsgG蛋白之间互作功能分析。体内融合表达csgE-csgG复合物，成功构建了pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-6His、pQLink-N-csgG-12GS-csgE-C-6His和pQLink-N-csgG-6GS-csgE-C-6His;将重组质粒转化到BL21菌中进行表达，通过Western blotting assay分析鉴定，并用镍柱亲和层析进行纯化，纯化后的融合蛋白CsgG-6GS-CsgE-C-6His进行聚集状态分析，发现融合蛋白主要以高聚的形式存在;进一步纯化CsgG-12GS-CsgE-C-6His、CsgG-14GS-CsgE-C-6His蛋白以及纯化条件的优化，均未能获得稳定的低聚融合蛋白;此外，开展体外重组的方式，分别将表达纯化好的CsgE、CsgF蛋白通过pull down试验，研究其与CsgG的互作;pull down试验结果表明CsgF、CsgE蛋白与CsgG蛋白均有相互作用。