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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)简称弓形虫,它是一种专性细胞内寄生原虫,几乎可感染所有的恒温动物。弓形虫病是全世界范围内感染最为普遍的人兽共患寄生虫病之一。弓形虫的生活史较为复杂,可寄生宿主众多,造成确诊困难,严重威胁了人类及畜牧业的发展。作为机体抵抗病原的第一道屏障,巨噬细胞在防御过程中是最容易受到感染的细胞之一,也是弓形虫急性感染中在全身散播的主要载体细胞,同时也为弓形虫的繁殖提供了有利场所,而弓形虫与巨噬细胞之间相互作用的研究是揭示弓形虫感染、传播和致病机制的重要基础。同时巨噬细胞又是重要的免疫细胞,弓形虫感染后对巨噬细胞极化产生什么样的影响,以及巨噬细胞极化对弓形虫增殖有何影响,这个问题的阐明无疑对进一步防控和治疗弓形虫病提供理论依据。本实验以小鼠骨髓来源的巨噬细胞为研究对象,通过用M-CSF体外诱导小鼠骨髓细胞分化为巨噬细胞后,分别用LPS+IFN-γ和IL-4刺激静息状态的巨噬细胞向M1型和M2型极化,并通过半定量PCR、western blot和FCM检测极化相关的标记分子表达水平,同时利用Griess法和精氨酸酶活性试验检测iNOS和Arginase-1两种酶的活性,建立小鼠骨髓来源巨噬细胞的体外极化模型。结果显示,LPS+IFN-γ刺激的巨噬细胞M1型相关基因在转录水平和蛋白水平均显著上调表达,而IL-4刺激的巨噬细胞M2相关基因均显著高表达。基于极化模型的成功建立,一方面研究体外小鼠巨噬细胞在弓形虫感染后极化的方向以及参与极化的信号通路活化状态。弓形虫感染巨噬细胞后0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h收集细胞和上清,Griess法和精氨酸酶活性试验检测iNOS和Arginase-1两种酶的活性,以及通过real-time PCR、western blot和FCM检测不同时间点极化相关基因表达的动态变化,结果表明,弓形虫感染后巨噬细胞具有高水平的精氨酸酶活性,而iNOS的酶活性没有明显变化,核酸和蛋白水平证明M2型标记分子显著高表达,而部分M1型标记分子只在核酸水平有短暂上调,蛋白水平没有显著变化。进一步通过western blot分析极化相关的JAK-STAT、Akt-mTOR信号通路的激活状态,结果表明弓形虫感染后激活了JAK-STAT6和Akt-mTOR信号通路。以上结果表明弓形虫感染后能够诱导巨噬细胞向M2型极化。另一方面为了评价M1、M2对弓形虫感染和增殖的影响,通过免疫荧光试验和western blot测定弓形虫的感染和增殖情况,结果表明,不同亚型巨噬细胞对弓形虫感染没有显著影响,但M1型巨噬细胞中弓形虫的增殖显著低于M0和M2型,表明M1型巨噬细胞对弓形虫增殖有明显的抑制作用。