疟疾是一种由疟原虫引起的传染病,在全世界范围内的发病率和致死率很高。据2017年世界疟疾报告统计,在2017年91个国家报告了总共2160万例疟疾病例,全球疟疾死亡人数达到73万人,同2015年数量大致相同。疟原虫是疟疾的病原体,通过按蚊传播给人类宿主。现已知有五种疟原虫属包括包括恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)及诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)在人体内均能导致疟疾的感染。人类和雌性按蚊是疟疾寄生虫的两种宿主。在人体内,疟原虫在肝细胞(肝期)和红细胞(红内期)中生长并进行无性繁殖,人是疟原虫的中间宿主。在蚊子中,如在血液中发现了配子细胞,预示着疟原虫在按蚊体内有性繁殖的开始,按蚊是疟原虫的终末宿主。携带疟原虫的雌性按蚊叮咬并感染宿主后,子孢子迅速被带入血液循环中并迅速迁移入肝脏并发展成为裂殖子。一个子孢子可以在5-8天内在肝细胞内产生10000-30000个子代的子孢子,这一时期我们称之为肝细胞期(红细胞外期)。当肝脏内裂殖子破裂后,子孢子开始入侵红细胞,在血液中循环,这一时期被称为红细胞内期。恶性疟原虫,间日疟原虫和卵形疟原虫的红内期大约是48小时,三日疟原虫大约需要3天,诺氏疟原虫仅需要1天左右。在红内期,一些滋养细胞转化成配子细胞。如果按蚊叮咬被感染的疟疾患者,蚊子体内疟原虫的有性繁殖就开始了。疟疾发作临床特征通常表现为周期性规律发作的发冷、发热,该疾病的主要并发症包括脑型疟疾(CM)、严重贫血、酸毒症、低血糖、高反应性疟疾脾肿大综合征(HMS)和毒性休克。近年来,多数国内外研究学者致力于疟疾疫苗的研发、疫苗使用效果及抗药性问题的探索和适应性免疫应答对疟疾病理过程的影响,许多研究表明天然免疫细胞在抵御疟原虫感染的过程中起到了很大的作用。由于疟原虫入侵人体并能成功引发疟疾感染的免疫反应过程和机制均相对复杂,以及目前人类疟疾寄生虫实验模型的局限性,许多已知的关于疟原虫的生物学研究都是由啮齿动物感染疟疾的模型所推断出来的。感染疟疾后的雌性按蚊通过叮咬的方式将子孢子传播入宿主体内,在红外期穿过皮肤表面侵入皮肤毛细血管,随后进入血液循环后转移至肝脏,43h后在肝细胞内发育成熟后,子孢子逐渐破裂释放出裂殖子,之后进入无性繁殖阶段。而人疟的红外期与鼠疟相比其周期可长达7-14天,裂殖子释放入血后则发育为红内期,不会返回肝脏。由于短暂的红外期是疟原虫侵入宿主的早期,在适应性免疫应答发生前,主要依赖于固有免疫抑制子孢子入侵肝细胞。NK细胞、NKT细胞、DC细胞和γδT细胞等都是天然免疫细胞的重要组成成分,在疟疾红内期协助机体抵御疟原虫的侵袭中做出了重要贡献。Toll-like receptors(TLRs)是一组高度保守的模式识别分子,在识别与病原体相关的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和在传染性病原体激活先天免疫应答上的作用不可或缺。TLRs配体是源自病原体的天然大分子成分,由脂质、蛋白质和核酸组成的。TLRs家族中TLR3、TLR7、TLR8和TLR9可以在细胞的核内体中进行了定位,并识别病毒DNA或RNA等核酸。TLRs表达多种天然免疫细胞,如巨噬细胞、DC细胞、B细胞、γδT细胞等,这些天然免疫细胞能在感染早期通过TLRs受体识别入侵的病原微生物而被活化,将TLRs激动剂与受体结合起来并能够激活复杂的细胞内信号转导通路(ERK、JNK、p38 MAP激酶和PI-3k激酶,转录因子IRF3/5/7、核因子NF-κB和AP-1),以协调炎症反应,进而抑制病原体的增殖和扩散。目前的研究已证,TLR2、TLR4以及TLR9参与了宿主天然免疫识别疟疾红内期的过程,而对于其他TLRs是否参与识别红内期仍不得而知。本课题主要研究方向是约氏疟原虫(Plasmodium yoelii,NSM)感染C57BL/6小鼠过程中脾脏中γδT细胞的特点以及γδT细胞在约氏疟原虫感染过程中的作用。本文分别从γδT细胞百分比和绝对数目、γδT细胞活化情况、分泌细胞因子水平等方面观察了小鼠感染约氏疟原虫后脾脏γδT细胞的功能变化,并使用约氏疟原虫感染γδTCR基因敲除小鼠,通过对红细胞感染率和生存率的检测来论证在约氏疟原虫感染C57BL/6小鼠过程中γδT细胞是否发挥了保护性免疫的作用。另外,通过检测γδT细胞中TLRs的表达情况,初步探讨TLRs在疟原虫感染过程中对γδT细胞的影响。本课题的主要研究内容如下:(1)建立约氏疟原虫NSM感染C57BL/6小鼠模型,用1×10~6约氏疟原虫感染的红细胞(parasitized red blood cell,pRBC)以尾静脉注射的方式感染C57BL/6雌性6-8周龄小鼠。自感染后D2开始,小鼠尾尖取血并制备薄血涂片,甲醇固定后用吉木萨染色,显微镜检iRBC占总RBC的百分比。每天观察并记录小鼠状态、红细胞感染率及死亡率情况,此外我们还应用显微镜采集了小鼠感染D14之内的血细胞涂片的图像、观察了C57BL/6小鼠感染约氏疟原虫后的脾脏的病理变化特点。结果表明,感染约氏疟原虫NSM后的小鼠(n=4)的原虫率在数天内迅速上升后又逐渐回落到较低水平。感染后D2,感染组小鼠血涂片镜下观察到极少量疟原虫感染的红细胞;感染后D3,感染组小鼠红细胞感染率仅为6.495±2.709%;随后疟原虫感染红细胞比例迅速升高,感染后D5,原虫率缓慢上升至14.1425±4.333%;在感染D6红细胞感染率降低至14.1425±4.333%;在感染后D14原虫率又出现逐渐上升并达到最大值(63.875±20.694%)(图1B)。在图1C中我们发现小鼠相继在感染后的D17、D18各死亡一只。结果表明,C57BL/6小鼠在感染后D14红细胞感染率飙升至峰值,此时小鼠感染后D14受疟原虫侵袭导致的病理变化显著。我们在感染后D14,将正常小鼠和感染小鼠的脾脏组织取出、拍照、称重后制备组织切片。通过HE染色,观察了约氏疟原虫NSM感染对小鼠脾脏病理变化的影响,发现脾脏组织病理改变严重,表明了脾脏在控制和建立慢性疟疾感染方面起着重要作用。(2)我们建立C57BL/6小鼠感染约氏疟原虫NSM模型,于感染后D14剖杀感染组小鼠,同时剖杀同龄正常小鼠作为对照组。分离脾脏、肠系膜淋巴结、肺脏、肝脏以及外周血淋巴细胞,并分别制备成单个细胞悬液后计数,使用细胞表面分子染色的方法,加入CD3单抗和γδTCR单抗,使用流式细胞技术观察CD3~+γδTCR~+的γδT细胞群在不同的器官中的绝对数目和百分比含量。结果显示,脾脏中CD3~+γδTCR~+细胞群感染后较对照组上升幅度明显,表明小鼠感染约氏疟原虫的过程中,脾脏中的γδT细胞发挥了重要作用。(3)建立约氏疟原虫NSM感染C57BL/6小鼠的模型,剖杀感染D2、D4、D6、D8、D10、D14小鼠,同时剖杀同龄正常小鼠作为对照,无菌分离脾脏后,制备脾脏单细胞悬液并计数。脾细胞进行细胞表面分子染色,使用流式细胞技术观察CD3~+γδTCR~+细胞亚群百分比含量的变化。与正常组相比感染后D2、D4、D6、D8、D10、D12、D14均有上升,其中感染后D14的CD3~+γδTCR~+百分比含量表达最高,表明γδT细胞在感染后D 14发挥明显作用。(4)用细胞表面染色的方法检测CD3~+γδTCR~+中表型及其活化情况。为了更进一步了解感染过程CD3~+γδTCR~+细胞群的γδT细胞分泌多种细胞因子的能力,在体外用刺激剂PMA加Ionomycin共同培养脾细胞5个小时,然后用细胞内细胞因子染色方法和流式细胞术检测IL-4、IFN-γ、IL-17、IL-22、IL-10和IL-5的分泌情况。结果如图5所示,先圈出CD3~+γδTCR~+的γδT细胞群,然后再观察这群细胞中的表面分子和细胞因子变化情况。一方面,感染后γδT细胞群中CD69的表达升高,CD25没有明显变化,CD40L和CD62L的含量降低,这说明感染后脾脏中γδT细胞明显活化,而细胞表面CD4和CD8的表达极低,而且正常小鼠和感染小鼠之间没有明显差异,这就进一步验证了,γδT细胞通常不表达CD4和CD8。γδT细胞能常规表达Vγ2和ICOS,且两者感染后均明显降低,证实ICOS在γδT细胞中具有调节作用,其中γδT细胞还表达PD1、PDL1、PDL2,并且感染后PD1的比例显著升高,说明严重感染期间它或许可作为过度炎症的反馈机制,起到了维持免疫平衡,限制由于过度免疫导致的病理反应。感染后,γδT细胞表面CXCR3、CX3CR1的表达并没有明显变化(图5),具体原因尚不清楚。另一方面,脾脏γδT细胞中IFN-γ比例升高,IL-5、IL-22的含量则没有明显变化,IL-17含量降低,表明感染后γδT细胞在感染过程中发挥了作用,能分泌更少的Th2型细胞因子(IL-4、IL-5)和更多的Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-10)和更少的TL17型细胞因子(IL-17)(图6)。(5)通过小鼠尾静脉感染野生型小鼠和γδT基因敲除小鼠,观察C57BL/6小鼠和γδT基因敲除小鼠红细胞感染率与死亡率的变化。结果显示,感染组小鼠(n=4)和γδT基因敲除小鼠的红细胞感染率均在数天内迅速上升后又逐渐回落,并发现在感染D4γδT基因敲除小鼠红细胞感染率(1.270±0.5241%,n=4)明显高于感染后的野生型小鼠(*P<0.05,3.180±1.094%,n=4),表明γδT细胞在感染早期参与了抵抗疟原虫感染的免疫应答过程。在图10B中我们发现γδT基因敲除小鼠全部存活,而对照组则在感染D21死亡一只。(6)建立约氏疟原虫感染C57BL/6小鼠模型,于感染D14剖杀,无菌制备脾细胞悬液,计数后,用细胞表面染色的方法检测CD3~+γδTCR~+群中γδT细胞中TLRs表达情况。流式细胞仪检测结果显示,感染后TLR2、TLR3、TLR4表达均有上升,说明在约氏疟原虫NSM感染过程中,存在可以激活TLR2、TLR3和TLR4的相关分子,能激活脾脏γδT细胞中相关受体,从而通过调节TLRs的方式参与宿主与疟原虫之间的免疫反应。