细胞的分化、发育、生长是一个复杂的过程，受到多种因素的调控。近来，人们发现在多种组织和器官的早期发育过程中，Notch家族成员对细胞的发育、生长、凋亡等起重要的调控作用。Notch基因编码I型跨膜糖蛋白，是保守的细胞膜表面受体，可以通过与邻近细胞表面表达的Notch配体相互作用而被激活。正常情况下，Notch信号由其配体诱导的蛋白水解反应触发。Notch蛋白裂解后从细胞膜上释放出Notch蛋白的胞内区（ICN）。ICN进入细胞核内，激活Su（H）/CBF1家族转录因子，通过对靶基因表达的调控，调节细胞的生长发育。利用转基因的方法可以使细胞表达Notch蛋白的胞内区ICN，ICN呈组成性活化状态，可模拟Notch信号活化，影响包括肿瘤细胞、免疫细胞、造血细胞在内的多种细胞的生长发育。目前已知该家族成员Notch1的信号传导在肿瘤形成过程中可产生两种不同的作用：促进肿瘤形成或抑制肿瘤细胞增殖。不同的Notch活化形式可能对不同的细胞有不同的作用。本课题通过观察Notch1对肝癌细胞生长和凋亡的影响，探讨Notch1信号的作用机制以及它与其他信号途径之间的相互作用。首先，我们通过磷酸钙沉淀法转染293T细胞制备出可同时表达组成性活化形式的Notch1（ICN）和绿色荧光蛋白（GFP）的逆转录病毒载体MSCV-ICN/GFP以及只表达标记基因GFP的对照组逆转录病毒载体MSCV-GFP，用以感染人肝癌细胞SMMC7721，使其高表达Notch1（ICN）。感染后第一天观察病毒的感染效率，流式细胞仪检测结果表明大约有45%~65%的SMMC7721细胞表达绿色荧光蛋白。用同样的感染方法感染人肝癌细胞Hep3B，MSCV-ICN/GFP的感染效率约为20%， 推测不同的肝癌细胞可能对我们所制备的逆转录病毒具有不同的易感性。随后，我们用MTT比色法观察了瞬时表达Notch1（ICN）对SMMC7721和Hep3B人肝癌细胞生长的影响，利用流式细胞仪分析细胞周期分布的变化。结果显示，与对照组相比，瞬时表达Notch1（ICN）的人肝癌细胞SMMC7721生长减缓， G0/G1期细胞增多，表明Notch1活化信号可以抑制人肝癌细胞的生长，使细胞停滞在G0/G1期。而Notch1活化信号对人肝癌细胞Hep3B生长的<WP=6>抑制作用较小，可能与逆转录病毒对Hep3B肝癌细胞的感染效率低于SMMC7721细胞有关。基于瞬时表达的Notch1（ICN）对肝癌细胞生长的抑制作用，为了了解稳定表达的Notch1（ICN）是否对SMMC7721肝癌细胞产生相同的作用，我们用有限稀释法分别筛选出稳定表达Notch1（ICN）的单克隆细胞株SMMC7721-ICN/GFP和稳定表达标记基因绿色荧光蛋白的单克隆细胞株SMMC7721-GFP，并利用克隆形成试验、3H-TdR掺入法和MTT比色法对其生长进行了分析，结果显示，与SMMC7721-GFP细胞 相比，SMMC7721-ICN/GFP细胞生长受到显著抑制，克隆形成能力明显降低。细胞周期分布的检测表明G0/G1期SMMC7721-ICN/GFP细胞增多， S期SMMC7721-ICN/GFP细胞减少，说明Notch1（ICN）的瞬时表达或者稳定表达都能够使肝癌细胞SMMC7721细胞周期分布发生改变，细胞停滞于G0/G1期。此外，我们还检测了SMMC7721-ICN/GFP细胞的IL-6水平，发现Notch1活化信号可刺激 SMMC7721细胞IL-6的分泌增多。细胞的增殖和死亡与细胞周期的进程密切相关，而细胞周期主要受由细胞周期素、细胞周期素依赖性激酶和细胞周期素依赖性激酶抑制剂构成的网络调控。为了进一步探讨Notch1活化信号抑制SMMC7721细胞生长及改变其细胞周期分布的机制，我们利用RT-PCR方法检测了一些细胞周期调控基因mRNA表达水平，初步结果显示瞬时和稳定表达Notch1（ICN）的SMMC7721细胞的细胞周期素依赖性激酶抑制剂p21mRNA表达水平上调， cyclinA、Cyclin D3、Cyclin E和CDK2 mRNA水平下调，提示Notch1活化信号可能通过影响细胞周期调控基因的表达使G0/G1期SMMC7721细胞增多。我们采用Western blot方法进一步分析了细胞周期调控蛋白的变化，证实Notch1（ICN）的稳定表达可以使Cyclin A和CDK2蛋白表达水平降低。在筛选SMMC7721-ICN/GFP和SMMC7721-GFP单克隆细胞株的过程中，我们发现稳定表达Notch1（ICN）的SMMC7721-ICN/GFP细胞生长明显迟缓，相差显微镜下可见部分细胞变圆、失去贴壁的特征，推测Notch1活化信号可能诱导了SMMC7721细胞的凋亡。PI染色法检测结果显示，表达Notch1（ICN）的SMMC7721细胞凋亡率显著高于表达GFP的对照组。用caspase3抑制剂处理细胞12小时和24小时，caspase3抑制剂在50μM浓度时可以促进SMMC7721-ICN/GFP细胞的增殖，而对SMMC7721细胞和SMMC7721-GFP细<WP=7>胞生长却有轻微的抑制作用，提示Notch1可能通过caspase3信号途径诱导了SMMC7721肝癌细胞的凋亡。采用Western 免疫印迹技术分析影响凋亡的细胞信号转导途径，证实Notch1（ICN）可以活化JNK，诱导p53的表达，提示Notch1（ICN）有可能通过激活JNK后使p53过度表达而抑制SMMC7721细胞的生长，并促进其凋亡，caspase3信号通路可能也参与了这一过程。TNFα相关的凋亡诱导配体（TNFα-related apoptosis inducing ligand,TRAIL）是TNF家族中与CD95L同源性最高的凋亡分子，能够诱导多种肿瘤细胞的凋亡；但与TNFα、CD95L不同的是，它对机体正常组织不具有明显的毒?