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2011年WHO发布报告,推荐使用糖化血红蛋白诊断糖尿病。作为糖尿病检测的指标,糖化血红蛋白特点为其检测结果反映的是患者过去两到三个月的平均血糖水平,但糖化血红蛋白作为临床诊断仍存在检测结果在不同实验室之间的可比性较差。根据NGSP的建议,为保证不同实验室之间的测量结果具有可比性,要求糖化血红蛋白测量系统的精密度,室内CV<3%,解决好不同实验室之间的差异是当前推荐糖化血红蛋白作为诊断标准的一个重点难题。免疫层析试剂条使用方便性及其快速诊断的优势使其应用范围越来越广,因为其易存储和便于运输的特性,在基层医疗机构应用较为广泛。本研究的重点在于希望通过选择出合适的配对组合的抗体,并优化各项试剂条的层析条件,从而获得与高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测结果具有较好可比性、易操作、成本低的糖化血红蛋白检测试剂条,便于进行糖尿病的诊断及监测并能在中国基层医院推广应用。1.通过各种实验最终获得的免疫层析试剂条基础建立条件为:(1)标记步骤为取离心管分别加入100μL的450 nm的荧光微球(固含量为1%),加入500μL的MES缓冲液(20 mM MES pH=5.6)、200μL 10 mg/mL EDC(20 mM MES pH=5.6溶解配制)和200μL的10 mg/mL NHS(20 mM MES pH=5.6溶解配制),震荡混匀后,反应20 min后加入500μL的PB缓冲液(20 mM PB pH=7.2)将荧光微球重悬,分别加入400μL的10 mg/mL的IHB001的抗体,反应30 min后,离心去上清,使用保存液重悬荧光微球颗粒(保存液为20 mM的pH=7.2 PB+0.1%BSA+10%蔗糖)。将悬浮的荧光微球颗粒以1.0μL/cm的量包被在金标垫上。(2)包被条件为用20 mM的PB(pH=7.2)缓冲液稀释成4 mg/mL的IHA001抗体包被在硝酸纤维素膜上。(3)溶血剂的组成配方为0.2%NaCl+0.1%CTAB。以上三个组分本研究中糖化血红蛋白试剂条的基础建立条件。2.采用Design-expert V8.0.6软件中的Box-Behnken Design(BBD)法进行内置质控来控制精密度因素的分析,分别对荧光素-BSA的比例、BSA浓度、标本用量和反应时间4个因素进行实验设计并优化反应条件,参照EP05-A3中关于精密度测定的方法,获得精密度预期在1.61%的层析条件。3.以开发的糖化血红蛋白免疫层析试剂条为基础,进行了一系列关于定量免疫层析试剂条的各项性能检验,获得的产品性能如下:本试剂条的糖化血红蛋白最低检出限为0.4%,线性范围为2.0%~14.0%,在此线性范围内,试剂盒的相关系数r≥0.99,精密度测量值为1.61%,干扰物质允许最大干扰浓度:甘油三酯为25 g/L,胆红素为0.1 g/L。通过对各项性能指标的检验数据分析,本研究所制备的糖化血红蛋白检测试剂条满足基层医院试用,性能达到预期要求。