本文主要从以下三个部分展开论述：　　第一部分 纳米雄黄混悬液的制备　　目的:雄黄是我国的传统中药,它的主要成分为硫化砷(As4S4或As2S2),另外还含有少量三氧化二砷(As2O3)及五氧化二砷(As2O5)。由于雄黄在临床上的特殊功效及其毒性反应,自古就很重视它的炮制处理。但雄黄难溶于水,胃肠道吸收差,生物利用度低,故临床用药剂量大,阻碍了雄黄的临床应用推广。目前,纳米技术的发展,为我们优化雄黄制剂提供了新的思路。我们在前人研究的基础上制备纳米雄黄混悬液,为雄黄体外抗肿瘤研究提供实验理论基础。　　方法:经去毒处理后按药典规定方法测得 As4S4含量为92.3％的雄黄原料粉,经球磨机粉碎,将过500目筛的雄黄样品3 g,加蒸馏水至300 mL,磁力搅拌器搅拌30 min,加入M-110EH型微射流制粒机30000rpm·min-1,10个循环,最后1次5000rpm·min-1。超声震荡30 min,再过0.22μm微孔滤器除菌,密封避光4℃保存。在Nicomp380 ZLS型粒度测定仪上测定粒度;采用砷钼蓝法测定样品中的砷含量;绘制标准曲线,测定样品中As2O3含量的变化;通过扫描电镜观察纳米雄黄混悬液的微观形貌。　　结果:应用微射流法制备了平均粒径为186.8 nm左右的纳米雄黄混悬液,其砷含量为9.27 mg·g-1, As2O3含量为1.86 mg·g-1。密封避光4℃保存,在60d内 As2O3含量略有增加(1.86 mg·g-1增加到2.1mg·g-1)。扫描电镜观察所得纳米雄黄颗粒颗粒均匀分散,没有发生团聚。说明纳米雄黄混悬液在密封避光4℃的环境中具备一定的物理稳定性。　　结论:制备了物理及化学特性较稳定的纳米雄黄混悬液。　　第二部分 宫颈癌SiHa细胞体外药敏试验　　目的:探讨纳米雄黄混悬液体外对宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞的抑制率,了解不同实体瘤细胞株对纳米雄黄混悬液的敏感性。　　方法:将纳米雄黄混悬液按倍比稀释法配制成不同实验浓度梯度的药物(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞不同时间段(12,24,48,72 h)后,应用MTT比色法比较其对不同实体瘤细胞抑制率的影响,并应用 Bliss法计算纳米雄黄混悬液对不同肿瘤细胞的半数有效浓度(IC50),检测不同实体瘤细胞株对纳米雄黄混悬液的敏感性。　　结果:MTT比色法显示,纳米雄黄混悬液对宫颈癌SiHa细胞、HeLa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞均有抑制作用,均呈时间-剂量依赖关系,与对照组比较有显著统计学意义(P<0.05);用Bliss法计算纳米雄黄混悬液对四株细胞的IC50值,结果分别为18.71 mg·L-1,38.95 mg·L-1,26.14mg·L-1和64.01 mg·L-1,由此可见,纳米雄黄混悬液抑制SihHa细胞增殖的作用最强。　　结论:对纳米雄黄混悬液的敏感度从高到低依次为宫颈癌SiHa细胞、乳腺癌MCF-7细胞、宫颈癌HeLa细胞、肝癌HepG2细胞。　　第三部分 纳米雄黄混悬液诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡机制的初步探讨　　第一节 宫颈癌中RCAS1表达与HPV16E6、HPV16E7表达的关系研究　　目的:探讨宫颈癌中RCAS1蛋白表达与HPV16E6、HPV16E7蛋白表达的关系,为进一步研究HPV感染的免疫逃逸机制提供理论依据。　　方法:1.采用免疫组化S-P(streptavidin-peroxidase)法,分别检测71例宫颈癌,76例子宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及20例正常宫颈组织中RCAS1蛋白与HPV16 E6、E7蛋白的表达,并分析其相关性。　　2.Western Blot检测宫颈癌SiHa细胞中RCAS1蛋白与HPV16 E6、E7蛋白的表达。　　结果:1. RCAS1蛋白主要表达于癌细胞膜和/或细胞浆,从正常宫颈组织到CIN再到宫颈癌组织,RCAS1蛋白的阳性表达率分别为0、39.47%和77.46%,提示随着宫颈病变恶性程度的进展RCAS1表达逐渐增强(P<0.05)。低分化宫颈癌组中RCAS1阳性表达显著高于高、中分化宫颈癌组(P<0.01);但与患者年龄、临床分期及组织学分型无关(P>0.05)。　　2.HPV16 E6蛋白主要表达于癌细胞核,从正常宫颈组织到CIN再到宫颈癌组织, HPV16 E6蛋白的阳性表达率分别为10%、35.53%和60.56%,提示随着宫颈病变恶性程度的进展HPV16 E6表达逐渐增强(P<0.05)。HPV16 E6阳性表达在低分化宫颈癌组中显著高于高、中分化宫颈癌组(P<0.01);但与患者年龄、临床分期、组织学分型无关(P>0.05)。　　3.HPV16 E7蛋白主要表达于癌细胞核,从正常宫颈组织到CIN再到宫颈癌组织, HPV16 E7蛋白的阳性表达率分别为5%、28.94%和61.97%,提示随着宫颈病变恶性程度的进展HPV16 E7表达均逐渐增强(P<0.05)。HPV16 E7在鳞癌组中的阳性表达显著高于腺癌组(P<0.01);但与患者年龄、临床分期、组织学分级无关(P>0.05)。　　4.宫颈病变组织中RCAS1蛋白的异常表达与HPV16E7蛋白阳性表达呈正相关(P<0.01),与HPV16E6蛋白阳性表达呈正相关(P<0.01)。　　5.通过Western Blot均检测到宫颈癌SiHa细胞中HPV16E6、E7蛋白及RCAS1蛋白的表达。　　结论:RCAS1蛋白在宫颈癌组织中表达增强,RCAS1表达强度与宫颈癌恶性程度相关;RCAS1阳性的宫颈癌组织中存在HPV16感染。宫颈癌SiHa细胞中存在RCAS1蛋白和HPV16E6、E7蛋白的表达。　　第二节 纳米雄黄混悬液诱导宫颈癌SiHa凋亡及对HPV16E6、E7和RCAS1表达的影响　　目的:初步探讨纳米雄黄混悬液诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的机制及HPV16E6、E7和RCAS1表达的影响。从一个新的角度对 HPV病毒的生物学性状进行研究,为宫颈癌的临床预防、治疗提供理论依据。　　方法:将不同质量浓度的纳米雄黄混悬液(6.25,12.5,25,50 mg·L-1)作用于宫颈癌SiHa细胞不同时间段(12,24,48,72 h),通过光镜和透射电镜观察实验组(不同质量浓度的纳米雄黄混悬液处理组)和对照组(不加药物的细胞)细胞的形态学变化;吖啶橙染色检测凋亡细胞;琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期改变;用RT-PCR方法检测Bcl-2、Bax、HPV16 E6、E7和RCAS1mRNA的表达;用 Western Blot方法检测HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表达量的变化。考察纳米雄黄混悬液对宫颈癌SiHa细胞的凋亡诱导效应。　　结果:1.纳米雄黄混悬液25,50 mg·L-1处理SiHa细胞48 h后,细胞存活率明显降低,凋亡增加,电镜显示细胞呈典型的凋亡形态学改变;细胞进行吖啶橙染色后大多表现为凋亡样变化;琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞DNA Ladder形成;流式细胞术检测表明纳米雄黄混悬液致细胞凋亡呈浓度依赖性,与对照组相比,差异有极显著意义(P<0.01),且细胞呈G0/G1期阻滞。　　2. RT-PCR检测结果显示,纳米雄黄混悬液25,50 mg·L-1处理SiHa细胞48,72 h后,宫颈癌SiHa细胞中Bcl-2、HPV16 E6、E7和RCAS1 mRNA的表达不同程度地受到抑制,而Bax mRNA的表达明显升高,与正常对照组比较,均有显著统计学差异(P<0.01)。而纳米雄黄混悬液6.25,12.5 mg·L-1组,上述表现与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)。　　3. Western Blot检测结果显示,纳米雄黄混悬液25,50 mg·L-1处理SiHa细胞48,72 h后,宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6、E7和RCAS1蛋白表达亦不同程度地受到抑制,与对照组比较有显著统计学差异(P<0.01),而纳米雄黄混悬液6.25,12.5 mg·L-1组,上述表现与正常对照组比较无统计学差异(P>0.05)。　　结论:纳米雄黄混悬液对于SiHa细胞具有诱导凋亡、抑制增殖的作用,可能与其降低Bcl-2/Bax比值有关,导致细胞凋亡可能主要通过线粒体介导发生的;纳米雄黄混悬液抑制了SiHa细胞中E6、E7 mRNA及蛋白的表达,同时也抑制了RCAS1mRNA及蛋白的表达,可能是其抗宫颈癌的另一机制。