天蓝色链霉菌强启动子的构建与应用研究

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链霉菌因具有强大的次级代谢能力而著称,大量研究表明链霉菌群体感应在调控次级代谢生物合成和形态分化过程中起着关键作用。实验室前期工作以链霉菌γ-丁酸内酯群体感应系统为研究对象,阐述了该调控系统在调控次级代谢及分化发育中的作用及其调控机制,发现在天蓝色链霉菌中γ-丁酸内酯受体ScbR和假γ-丁酸内酯受体ScbR2都能够结合kasO启动子,且Sigma因子HrdB可以增强其转录活性。为了在链霉菌中得到一个广谱的组成型强启动子,我们首先在大肠杆菌中进行分析,证实在大肠杆菌中kasO启动子表现为组成型启动子。本论文以提高该启动子活性为目的,首先去除其OB结合位点并截短其长度,得到活性最强的kasOp3,然后通过随机突变OA位点构建启动子库,筛选验证得到活性最强的kasOp*。本工作还分别用xylE和卡那报告基因在天蓝色链霉菌,阿维链霉菌和委内瑞拉链霉菌比较了kasOp*、SF14p和ermEp*三个启动子的活性,结果显示kasOp*活性最高,转录时序和过表达actII-ORF4均证实ksaOp*是一个更理想的组成型强启动子。本论文工作还提供了一个启动子活性评价方法,为后续的启动子探测提供了思路。多杀菌素是对农业虫害防治及粮食仓储安全均具有重大意义的农用抗生素,但是其生理周期长、产量低等条件制约了其的推广及应用。为了深入揭示刺糖多孢菌合成多杀菌素的调控特点以便更好的应用于产量提高,本论文也对相关方向进行了探讨。首先采用上述建立的xylE,neo报告基因启动子探测技术,探测了位于多杀菌素生物合成基因簇内的9个启动子活性,并进一步通过荧光定量PCR(qPCR),分析了这9个基因的转录时序,还分析了不在基因簇内但对多杀菌素糖基合成修饰所必需的负责糖基前体供应和鼠李糖合成的4个基因的转录时序,结果表明多杀菌素生物合成基因簇内的9个基因在菌体生长进入稳定期时有较高的转录,这和发酵培养时发酵液中此时开始大量积累多杀菌素一致;本论文工作还发现,位于簇外的4个与糖基供应相关的基因和基因簇内基因的转录时序不同,它们在菌体生长对数期有较高的转录活性,这暗示多杀菌素聚酮链的合成速率和参与后修饰的糖基底物供应的最优化匹配有可能是是提高生物合成多杀菌素的前提和关键。
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