丹参是我国的传统药材,以根及根茎入药,主要有效成分为丹参酮和丹酚酸。其中,松香烷型二萜类化合物丹参酮,在治疗心血管疾病中具有显著疗效。目前,丹参酮的生物合成途径已被逐步解析,已有研究证明,SmCPS1的丹参酮生成合成的关键酶。本研究以丹参SmCPS1的启动子为诱饵,通过酵母单杂筛选丹参c DNA文库,获得与之互作的两个WRKY转录因子和一个干旱诱导蛋白,以其中的SmWRKY44为对象,在本试验中重点解析SmWRKY44的功能和作用机制。通过遗传转化试验表明SmWRKY44促进丹参毛状根中丹参酮积累;又通过q RT-PCR、Y1H、EMSA、Ch IP-qPCR和Dual-Luc报告试验,揭示SmWRKY44促进丹参毛状根中丹参酮生物合成的分子机制。主要结果如下:1、从丹参中克隆了1771bp的SmCPS1启动子,利用SmCPS1启动子为诱饵,酵母单杂交筛选丹参c DNA文库,获得与之互作的WRKY转录因子SmWRKY44;进而克隆了SmWRKY44基因,其CDS为798bp,编码265个氨基酸;表达分析表明其在根和茎中高表达,且响应JA、SA、低温、干旱和盐胁迫;亚细胞定位试验表明SmWRKY44定位于细胞核。2、通过发根农杆菌C58C1介导的遗传转化获得SmWRKY44过表达和RNAi毛状根。与野生型毛状根相比,过表达毛状根中隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIa含量显著增多,相反地,在RNAi毛状根中,三种丹参酮含量均显著减少;进一步地,对转基因毛状根中丹参酮生物合成途径关键基因进行了表达分析,结果表明SmCPS1,SmCPS5和SmKSL1的与SmWRKY44的表达模式一致。为了进一步解析SmWRKY44促进丹参酮生物合成的分子机制,利用Y1H,Ch IP-qPCR,EMSA和Dual-Luc试验验证了SmWRKY44在体外和丹参体内可直接结合SmCPS1,SmCPS5和SmKSL1的启动子中的W-box,并能激活这三个基因的转录。综上所述,本研究揭示了SmWRKY44通过直接结合SmCPS1,SmCPS5和SmKSL1的启动子中的W-box并激活它们的转录,从而促进丹参酮的生物合成的分子机制。