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研究目的
据世界卫生组织公布的2020年全球最新癌症负担数据统计，乳腺癌新发病例数快速增长，成为全球第一大癌症。放射治疗(Radiotherapy，RT)是临床上应用广泛且高效的癌症治疗手段，其主要机制是通过损伤DNA的方式引起肿瘤细胞直接死亡[1]。然而近年来，辐射诱导的“远端效应”引起临床医师和肿瘤学家的关注。远端效应是指对原发肿瘤部位进行局部放射治疗后，非受照区的肿瘤产生肿瘤自发消退，其机制被认为是一种RT刺激的全身抗肿瘤免疫反应[2]。然而，事实上，由于放疗也可诱导产生免疫抑制，使得远端效应的发生较为罕见。如何有效克服放疗诱导的免疫抑制，增强局部RT的全身抗肿瘤疗效以及促进远端效应发生是该领域关注的焦点问题。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境中主要的细胞群，约占肿瘤基质的50％，肿瘤中大多数TAMs呈M2型，与肿瘤的生长、转移和侵袭[3]密切相关。但TAMs是一类可塑性极强的免疫细胞群体，能够在抗肿瘤M1型和促肿瘤M2型之间转换。M1型巨噬细胞可诱导促炎因子的释放，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。推测认为“重塑”TAMs向抗肿瘤M1表型极化可能能够促进远端效应的发生。因此，寻找一种能通过特异地促进TAMs向M1型分化并诱发远端效应的制剂是该领域的当务之急。
我们前期研究表明，2-己基-4-戊烯酸(2-hexyl-4-pentylenacid，HPTA)，一种丙戊酸衍生物，具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)功能，是一种通过降低DNA修复蛋白活性和增加细胞凋亡来治疗乳腺癌的新型药物[4]，最近的一项研究发现TMP195(一种Ⅱa类HDACi)可通过调节TAMs向抗肿瘤M1表型极化来抑制肿瘤细胞增殖，并诱导乳腺肿瘤血管正常化来减少转移[5]，因此，HDACis类制剂可能能够影响TAMs的极化，但对于HPTA是否具备影响TAMs分化的能力，以及RT联合HPTA是否能够刺激放疗诱导的远端效应发生尚未有文献报道。
本课题旨在研究HPTA联合RT是否能够刺激远端效应发生，并在此基础上探讨其发生的机制，为增强局部放疗的全身抗肿瘤疗效提供可靠的理论指导，对于有肿瘤转移的乳腺癌患者的防治也具有重要的临床意义。
研究方法
1.辐射诱导的远端效应动物模型的建立
取50日龄雌性SD大鼠(体重150±15g)，将溶于植物油中的环境致癌剂二甲基苯并[a]蒽(DMBA)经口一次性灌胃，在DMBA灌胃后大约90天左右，大鼠原发性乳腺肿瘤成功被诱导。随后在原发性乳腺肿瘤模型基础上，建立辐射诱导的远端效应动物模型。选取20只肿瘤数目达2个或2个以上的大鼠随机分为4组:对照组(control)、单独HPTA组、单独RT组和RT联合HPTA组(RT+HPTA)。对照组不做任何处理;HPTA组以及联合给药组均在相同时间经腹腔注射HPTA20mg/kg，连续给药6天，共给药12次，每次间隔12小时;对于照射，只选择1个肿瘤作为辐照肿瘤进行局部精确辐照，其余肿瘤作为非受照区肿瘤，RT组与RT+HPTA组照射总剂量分别为8Gy，处理方式为剂量分割(2Gy/次/天，共4次)，均在给药后第二天同一时间进行照射处理。在处理后第10天处死部分大鼠进行实验检测，其余大鼠持续观察肿瘤变化直到第35天。
2.动物肿瘤体积测量
给予照射和药物处理后，每周记录照射和未照射肿瘤体积的变化，按照临床标准公式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)=长(L)×宽(W)2/2。
3.未照射区肿瘤组织病理观察
通过HE染色观察乳腺肿瘤组织的病理形态学变化。
4.未照射区肿瘤细胞增殖能力的检测
在大鼠处死前24h给予腹腔注射5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)100mg/kg，通过免疫组织化学染色检测远端非受照区肿瘤组织中BrdU和ki67增殖标志物的表达。
5.未照射区肿瘤的巨噬细胞表型鉴定
①巨噬细胞的鉴定:通过免疫组织化学法和免疫荧光共染法检测巨噬细胞标志物F4/80、CD68和CD11b，研究巨噬细胞的数量及分布;②关于巨噬细胞极化状态的鉴定:通过免疫荧光共染法、qRT-PCR和蛋白印迹实验分别检测M1/M2型巨噬细胞的表面标志物(CD86/CD163+)与功能标志物(iNOS/Arg-1+)的表达，研究巨噬细胞的极化。
6.未照射区肿瘤的巨噬细胞相关炎性因子的检测
采用qRT-PCR检测与M1型和M2型巨噬细胞活性相关的炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-10和TGF-β等因子的表达水平。
7.未照射区肿瘤组织的血管检测
通过免疫印迹实验检测未受照肿瘤组织中具有血管生成特性因子IFN-γ的蛋白表达水平;采用血管内皮细胞表面标记物CD31和CD34，通过免疫荧光染色评估非受照区肿瘤血管密度和完整性。
统计分析
所有实验数据以平均值±标准差((X)±S)表示，数据采用单因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01，认为差异具有统计学意义。
研究结果
1.HPTA能够刺激RT诱导的远端效应，显著延缓未受照区乳腺肿瘤的生长
通过HE染色观察DMBA诱导的乳腺肿瘤组织的形态学结构，我们发现，正常乳腺组织中可见少量乳腺导管，且腺泡结构完整，而经DMBA诱导的乳腺肿瘤组织中可见大量乳腺导管的异常增生和间质纤维化，乳腺组织腺泡结构消失，乳腺导管内细胞大量增生，且排列紊乱，呈现典型的肿瘤组织细胞形态，这表明大鼠原发性乳腺癌模型成功被诱导。随后建立大鼠乳腺癌放疗诱导的远端效应模型(见方法1)。通过观察35天内肿瘤的体积变化，我们发现，与对照组相比，单独RT组直接受照肿瘤的生长被显著抑制(P＜0.01)，但对非受照区肿瘤的生长无显著影响。与单独RT组相比，RT联合HPTA对直接受照肿瘤的生长抑制更为显著(P＜0.0001)。重要的是，与单独RT处理组相比，RT+HPTA联合治疗组未照射区肿瘤的生长也受到了明显抑制，结果提示药物HPTA能够触发RT诱导的远端效应。
2.HPTA联合RT能有效抑制远端非照射区肿瘤细胞的增殖，并促进髓源性肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤微环境的浸润
通过HE染色，我们观察到对照组中有大量异常增生的恶性细胞和间质纤维化，单独HPTA可引起肿瘤组织少量空洞坏死，单独RT组非受照区肿瘤组织中可见少量空腔，但与对照组相比无明显差异。而RT联合应用HPTA后非受照区肿瘤组织中出现大量空泡状坏死区域，结果表明HPTA与RT联合治疗可导致远端未受照肿瘤组织明显坏死。
BrdU和Ki67两种增殖标志物的免疫组织化学染色结果显示，对照组远端未照射区肿瘤组织中可见大量增殖细胞，单独HPTA组和单独RT组中增殖细胞数有所减少(P＜0.05)，但无显著差异，而在HPTA联合RT组中增殖细胞明显减少(P＜0.01)。结果表明RT联合HPTA后远端非受照区肿瘤细胞的增殖能力明显降低。
巨噬细胞特异性标记物F4/80和CD68的免疫组化染色结果显示，对照组肿瘤组织中巨噬细胞较少，单独HPTA组和单独RT组非受照区肿瘤组织中巨噬细胞稍增多(P＜0.05)，而RT+HPTA组非受照区肿瘤组织中巨噬细胞明显增多(P＜0.01)，且主要位于肿瘤坏死形成的空泡区，提示联合治疗可有效促进巨噬细胞向远端非受照区肿瘤间质募集和浸润，清除肿瘤细胞。骨髓细胞标记物CD11b和F4/80免疫组化和免疫荧光共染色结果显示RT联合HPTA组非受照区肿瘤组织中CD11b+单核细胞数量较其他组显著增加(P＜0.01)，且CD11b和F4/80两种染色细胞的数量显著高于单独HPTA组、单独RT组和对照组(P＜0.01)。
上述结果表明RT联合HPTA可诱导髓源性TAMs向非受照区肿瘤微环境浸润，提示未照射肿瘤中浸润的TAMs可能是其远端效应产生的原因。
3.HPTA重编程非照射区TAMs向抗肿瘤M1型极化，逆转RT引起的M1/M2巨噬细胞比例下降
qRT-PCR结果显示，与对照组相比，HPTA组未照射肿瘤组织中CD86(M1型)表达升高，CD163(M2型)表达降低，而单独RT组M1降低，M2升高。HPTA+RT组相比单独RT组非受照区肿瘤组织中M1表达显著升高(P＜0.01)，M2下降，且M1/M2比例升高。qRT-PCR和蛋白印迹实验结果显示四组非受照区肿瘤组织中M1型和M2型功能性标志物iNOS/Arg-1比例也呈现相同的趋势(P＜0.01)。以上结果表明，应用HPTA可以改变TAMs的极化方向，使之向抗肿瘤M1型极化，单独RT则使TAMs向促肿瘤M2型极化，RT联合HPTA相对于单独RT有抑制TAMs向M2型分化的趋势。
我们进一步检测了非受照区肿瘤微环境中与M1和M2型巨噬细胞参与的免疫反应相关的炎性因子的表达。结果显示，与单独RT组相比，联合组非受照区肿瘤微环境中与M2型巨噬细胞免疫活性相关的炎性因子TGF-β和IL-10显著降低，而与M1型巨噬细胞相关的促炎因子IFN-、TNF-α和IL-12显著升高。F4/80和CD86两种标记物的免疫荧光共染色结果也进一步证实了HPTA能够重编程TAMs向抗肿瘤M1表型分化，逆转RT诱导的M1/M2巨噬细胞比例下降，从而增强抗肿瘤作用。
4.HPTA抑制非照射区肿瘤的新血管生成
qRT-PCR和蛋白印迹分析结果都显示联合组中非受照区肿瘤组织中具有抗血管生成特性的因子IFN-γmRNA水平和蛋白水平显著高于其他各组(P＜0.01)。通过血管内皮细胞表面标志物CD31和CD34的免疫荧光染色分析，我们发现RT+HPTA组远端非受照区肿瘤中CD31+和CD34+标记的血管大小和密度与其他组相比明显减少，且血管异常分支减少，表明肿瘤新血管生成受到抑制，血管系统的完整性得到改善。上述结果提示，HPTA联合RT可抑制非照射区肿瘤新生血管形成，促进血管正常化，其作用可能与抗肿瘤M1巨噬细胞分泌的因子IFN-γ有关。
研究结论
1.在本研究中，单独放疗时不能引起远端效应，HPTA可有效促进辐射远端效应的发生。
2.HPTA可促使非受照区肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤M1型极化，促进促炎因子的分泌和释放，表现出促炎作用。
3.HPTA可有效抑制非受照区肿瘤血管生成，促进血管正常化，其机制可能与IFN-γ有关。
据世界卫生组织公布的2020年全球最新癌症负担数据统计，乳腺癌新发病例数快速增长，成为全球第一大癌症。放射治疗(Radiotherapy，RT)是临床上应用广泛且高效的癌症治疗手段，其主要机制是通过损伤DNA的方式引起肿瘤细胞直接死亡[1]。然而近年来，辐射诱导的“远端效应”引起临床医师和肿瘤学家的关注。远端效应是指对原发肿瘤部位进行局部放射治疗后，非受照区的肿瘤产生肿瘤自发消退，其机制被认为是一种RT刺激的全身抗肿瘤免疫反应[2]。然而，事实上，由于放疗也可诱导产生免疫抑制，使得远端效应的发生较为罕见。如何有效克服放疗诱导的免疫抑制，增强局部RT的全身抗肿瘤疗效以及促进远端效应发生是该领域关注的焦点问题。
肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是肿瘤微环境中主要的细胞群，约占肿瘤基质的50％，肿瘤中大多数TAMs呈M2型，与肿瘤的生长、转移和侵袭[3]密切相关。但TAMs是一类可塑性极强的免疫细胞群体，能够在抗肿瘤M1型和促肿瘤M2型之间转换。M1型巨噬细胞可诱导促炎因子的释放，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。推测认为“重塑”TAMs向抗肿瘤M1表型极化可能能够促进远端效应的发生。因此，寻找一种能通过特异地促进TAMs向M1型分化并诱发远端效应的制剂是该领域的当务之急。
我们前期研究表明，2-己基-4-戊烯酸(2-hexyl-4-pentylenacid，HPTA)，一种丙戊酸衍生物，具有组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)功能，是一种通过降低DNA修复蛋白活性和增加细胞凋亡来治疗乳腺癌的新型药物[4]，最近的一项研究发现TMP195(一种Ⅱa类HDACi)可通过调节TAMs向抗肿瘤M1表型极化来抑制肿瘤细胞增殖，并诱导乳腺肿瘤血管正常化来减少转移[5]，因此，HDACis类制剂可能能够影响TAMs的极化，但对于HPTA是否具备影响TAMs分化的能力，以及RT联合HPTA是否能够刺激放疗诱导的远端效应发生尚未有文献报道。
本课题旨在研究HPTA联合RT是否能够刺激远端效应发生，并在此基础上探讨其发生的机制，为增强局部放疗的全身抗肿瘤疗效提供可靠的理论指导，对于有肿瘤转移的乳腺癌患者的防治也具有重要的临床意义。
研究方法
1.辐射诱导的远端效应动物模型的建立
取50日龄雌性SD大鼠(体重150±15g)，将溶于植物油中的环境致癌剂二甲基苯并[a]蒽(DMBA)经口一次性灌胃，在DMBA灌胃后大约90天左右，大鼠原发性乳腺肿瘤成功被诱导。随后在原发性乳腺肿瘤模型基础上，建立辐射诱导的远端效应动物模型。选取20只肿瘤数目达2个或2个以上的大鼠随机分为4组:对照组(control)、单独HPTA组、单独RT组和RT联合HPTA组(RT+HPTA)。对照组不做任何处理;HPTA组以及联合给药组均在相同时间经腹腔注射HPTA20mg/kg，连续给药6天，共给药12次，每次间隔12小时;对于照射，只选择1个肿瘤作为辐照肿瘤进行局部精确辐照，其余肿瘤作为非受照区肿瘤，RT组与RT+HPTA组照射总剂量分别为8Gy，处理方式为剂量分割(2Gy/次/天，共4次)，均在给药后第二天同一时间进行照射处理。在处理后第10天处死部分大鼠进行实验检测，其余大鼠持续观察肿瘤变化直到第35天。
2.动物肿瘤体积测量
给予照射和药物处理后，每周记录照射和未照射肿瘤体积的变化，按照临床标准公式计算肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)=长(L)×宽(W)2/2。
3.未照射区肿瘤组织病理观察
通过HE染色观察乳腺肿瘤组织的病理形态学变化。
4.未照射区肿瘤细胞增殖能力的检测
在大鼠处死前24h给予腹腔注射5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)100mg/kg，通过免疫组织化学染色检测远端非受照区肿瘤组织中BrdU和ki67增殖标志物的表达。
5.未照射区肿瘤的巨噬细胞表型鉴定
①巨噬细胞的鉴定:通过免疫组织化学法和免疫荧光共染法检测巨噬细胞标志物F4/80、CD68和CD11b，研究巨噬细胞的数量及分布;②关于巨噬细胞极化状态的鉴定:通过免疫荧光共染法、qRT-PCR和蛋白印迹实验分别检测M1/M2型巨噬细胞的表面标志物(CD86/CD163+)与功能标志物(iNOS/Arg-1+)的表达，研究巨噬细胞的极化。
6.未照射区肿瘤的巨噬细胞相关炎性因子的检测
采用qRT-PCR检测与M1型和M2型巨噬细胞活性相关的炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-6、IL-10和TGF-β等因子的表达水平。
7.未照射区肿瘤组织的血管检测
通过免疫印迹实验检测未受照肿瘤组织中具有血管生成特性因子IFN-γ的蛋白表达水平;采用血管内皮细胞表面标记物CD31和CD34，通过免疫荧光染色评估非受照区肿瘤血管密度和完整性。
统计分析
所有实验数据以平均值±标准差((X)±S)表示，数据采用单因素方差分析。P＜0.05或P＜0.01，认为差异具有统计学意义。
研究结果
1.HPTA能够刺激RT诱导的远端效应，显著延缓未受照区乳腺肿瘤的生长
通过HE染色观察DMBA诱导的乳腺肿瘤组织的形态学结构，我们发现，正常乳腺组织中可见少量乳腺导管，且腺泡结构完整，而经DMBA诱导的乳腺肿瘤组织中可见大量乳腺导管的异常增生和间质纤维化，乳腺组织腺泡结构消失，乳腺导管内细胞大量增生，且排列紊乱，呈现典型的肿瘤组织细胞形态，这表明大鼠原发性乳腺癌模型成功被诱导。随后建立大鼠乳腺癌放疗诱导的远端效应模型(见方法1)。通过观察35天内肿瘤的体积变化，我们发现，与对照组相比，单独RT组直接受照肿瘤的生长被显著抑制(P＜0.01)，但对非受照区肿瘤的生长无显著影响。与单独RT组相比，RT联合HPTA对直接受照肿瘤的生长抑制更为显著(P＜0.0001)。重要的是，与单独RT处理组相比，RT+HPTA联合治疗组未照射区肿瘤的生长也受到了明显抑制，结果提示药物HPTA能够触发RT诱导的远端效应。
2.HPTA联合RT能有效抑制远端非照射区肿瘤细胞的增殖，并促进髓源性肿瘤相关巨噬细胞向肿瘤微环境的浸润
通过HE染色，我们观察到对照组中有大量异常增生的恶性细胞和间质纤维化，单独HPTA可引起肿瘤组织少量空洞坏死，单独RT组非受照区肿瘤组织中可见少量空腔，但与对照组相比无明显差异。而RT联合应用HPTA后非受照区肿瘤组织中出现大量空泡状坏死区域，结果表明HPTA与RT联合治疗可导致远端未受照肿瘤组织明显坏死。
BrdU和Ki67两种增殖标志物的免疫组织化学染色结果显示，对照组远端未照射区肿瘤组织中可见大量增殖细胞，单独HPTA组和单独RT组中增殖细胞数有所减少(P＜0.05)，但无显著差异，而在HPTA联合RT组中增殖细胞明显减少(P＜0.01)。结果表明RT联合HPTA后远端非受照区肿瘤细胞的增殖能力明显降低。
巨噬细胞特异性标记物F4/80和CD68的免疫组化染色结果显示，对照组肿瘤组织中巨噬细胞较少，单独HPTA组和单独RT组非受照区肿瘤组织中巨噬细胞稍增多(P＜0.05)，而RT+HPTA组非受照区肿瘤组织中巨噬细胞明显增多(P＜0.01)，且主要位于肿瘤坏死形成的空泡区，提示联合治疗可有效促进巨噬细胞向远端非受照区肿瘤间质募集和浸润，清除肿瘤细胞。骨髓细胞标记物CD11b和F4/80免疫组化和免疫荧光共染色结果显示RT联合HPTA组非受照区肿瘤组织中CD11b+单核细胞数量较其他组显著增加(P＜0.01)，且CD11b和F4/80两种染色细胞的数量显著高于单独HPTA组、单独RT组和对照组(P＜0.01)。
上述结果表明RT联合HPTA可诱导髓源性TAMs向非受照区肿瘤微环境浸润，提示未照射肿瘤中浸润的TAMs可能是其远端效应产生的原因。
3.HPTA重编程非照射区TAMs向抗肿瘤M1型极化，逆转RT引起的M1/M2巨噬细胞比例下降
qRT-PCR结果显示，与对照组相比，HPTA组未照射肿瘤组织中CD86(M1型)表达升高，CD163(M2型)表达降低，而单独RT组M1降低，M2升高。HPTA+RT组相比单独RT组非受照区肿瘤组织中M1表达显著升高(P＜0.01)，M2下降，且M1/M2比例升高。qRT-PCR和蛋白印迹实验结果显示四组非受照区肿瘤组织中M1型和M2型功能性标志物iNOS/Arg-1比例也呈现相同的趋势(P＜0.01)。以上结果表明，应用HPTA可以改变TAMs的极化方向，使之向抗肿瘤M1型极化，单独RT则使TAMs向促肿瘤M2型极化，RT联合HPTA相对于单独RT有抑制TAMs向M2型分化的趋势。
我们进一步检测了非受照区肿瘤微环境中与M1和M2型巨噬细胞参与的免疫反应相关的炎性因子的表达。结果显示，与单独RT组相比，联合组非受照区肿瘤微环境中与M2型巨噬细胞免疫活性相关的炎性因子TGF-β和IL-10显著降低，而与M1型巨噬细胞相关的促炎因子IFN-、TNF-α和IL-12显著升高。F4/80和CD86两种标记物的免疫荧光共染色结果也进一步证实了HPTA能够重编程TAMs向抗肿瘤M1表型分化，逆转RT诱导的M1/M2巨噬细胞比例下降，从而增强抗肿瘤作用。
4.HPTA抑制非照射区肿瘤的新血管生成
qRT-PCR和蛋白印迹分析结果都显示联合组中非受照区肿瘤组织中具有抗血管生成特性的因子IFN-γmRNA水平和蛋白水平显著高于其他各组(P＜0.01)。通过血管内皮细胞表面标志物CD31和CD34的免疫荧光染色分析，我们发现RT+HPTA组远端非受照区肿瘤中CD31+和CD34+标记的血管大小和密度与其他组相比明显减少，且血管异常分支减少，表明肿瘤新血管生成受到抑制，血管系统的完整性得到改善。上述结果提示，HPTA联合RT可抑制非照射区肿瘤新生血管形成，促进血管正常化，其作用可能与抗肿瘤M1巨噬细胞分泌的因子IFN-γ有关。
研究结论
1.在本研究中，单独放疗时不能引起远端效应，HPTA可有效促进辐射远端效应的发生。
2.HPTA可促使非受照区肿瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤M1型极化，促进促炎因子的分泌和释放，表现出促炎作用。
3.HPTA可有效抑制非受照区肿瘤血管生成，促进血管正常化，其机制可能与IFN-γ有关。