迭宫属绦虫的中绦期幼虫——裂头蚴,可在人和动物体内寄生,引起人兽共患的裂头蚴病。目前我们对迭宫属绦虫的病原生物学特征及适应性寄生机制仍所知甚少。组学测序及分析技术的进步,为我们理解寄生虫的适应性进化机制提供了新的手段。然而至今尚无迭宫绦虫不同生活史时期的转录组数据,亦不知哪些基因家族在迭宫绦虫的适应性进化中起关键作用。本研究分两个部分:第一部分首先基于Illumina平台,使用RNA-Seq方法,对欧猬迭宫绦虫（Spirometra erinaceieuropaei）的成虫和裂头蚴进行转录组的从头测序;进而对不同生活史时期的虫体进行比较转录组分析,筛选出差异表达基因、期特异性表达基因及表达上调基因;最后对差异基因进行GO和KEGG富集分析,以进一步了解差异基因的功能。比较基因组及转录组学分析结果发现脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein,FABP）家族在迭宫绦虫特异性高表达,因此,我们在第二部分对欧猬迭宫绦虫的脂肪酸结合蛋白进行深入分析:首先对SeFABP基因进行克隆表达获得重组rSeFABP;然后采用RT-PCR、Real-time PCR、免疫荧光（IFA）及Western Blot等对rSeFABP的分子生物学特征进行分析,接着通过脂肪酸结合实验等对rSeFABP的功能进行鉴定;最后对FABP家族序列进行了系统发育分析。本研究结果不仅提供了高质量的欧猬迭宫绦虫的转录组数据,而且为脂肪酸结合蛋白的分子特征及进化模式研究奠定基础。材料与方法1.寄生虫和实验动物裂头蚴:选取河南省郑州市黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）裂头蚴分离株作为标准株,取头节,经口感染昆明小鼠保种备用。成虫:取保种小鼠的裂头蚴,经口感染6月龄雌性无病原体斑猫,感染后40天,将猫麻醉并安乐死,从小肠中获取成虫,用生理盐水清洗3次,使用4%多聚甲醛对幼节、成节和孕节进行固定,加入少量TRIzol冻存幼节、成节用于后续RNA提取等实验;成虫经形态学与分子生物学鉴定为欧猬迭宫绦虫。实验及保种小鼠:4-6周龄雌性BALB/c小鼠及保种昆明小鼠购买自河南省实验动物中心。2.菌种和质粒菌种选取大肠杆菌BL21,为本实验室冻存;克隆载体选取pMD19-T（Takara）,表达载体选取pMAL-c2X（New England Biolabs）。3.转录组测序使用TRIzol和RNeasyMini Kit试剂,按照说明书上的操作步骤,分别从欧猬迭宫绦虫的裂头蚴及成虫中提取总RNA。所有RNA样品在上机测序之前使用DNase处理。每个样本的总RNA经Agilent 2100生物分析仪进行质量检测。使用Nano Drop对RNA浓度和纯度进行测定。RNA完整性用1%琼脂糖凝胶电泳检测。每个样本进行三次生物学重复。文库的制备根据Illumina的操作说明构建。使用Oligo（DT）从总RNA中纯化筛选含多聚A的m RNA,接着纯化后的m RNA被分割成短片段,并以m RNA片段为模板合成cDNA。短片段cDNA两端均连接接头。使用PCR纯化和富集目的cDNA产物,最终建立可检索的双链cDNA文库。然后用Agilent 2100生物分析仪对文库进行质量鉴定,并用Qubit 2.0荧光计对文库进行定量。最后,在金唯智公司的Illumina Hi Seq 2000测序仪中,对文库进行配对末端测序。4.转录组组装及功能注释使用软件Cutadapt对原始读长序列进行过滤,从而获得高质量的纯净数据。使用Trinity程序对转录组进行从头组装。使用Trans Decoder预测每个转录本中的开放阅读框（ORF）。使用RSEM软件对转录组进行定量分析。使用BLASTp和BLASTx对每一转录本进行注释,根据对不同数据库的搜索来判断新测序的转录本与数据库中已有的序列的相似性,搜索的数据库包括:蛋白质Nr数据库,GO数据库,KEGG数据库和COG数据库。此外,利用MISA-Web工具对核苷酸序列中的简单重复序列（SSRs）进行了鉴定。在SSR鉴定前,去除UTs末端区域的poly-A和poly-T序列。5.差异表达基因（DEG）分析及qRT-PCR验证采用FPKM方法对裂头蚴期和成虫期差异表达基因（DEG）的表达水平进行比较。此外,我们还对差异表达基因进行了GO功能分析和KEGG通路分析。通过GO数据库对DEG进行富集分析,并计算每个GO条目的基因数。通过KEGG通路分析确定与DEGs显著相关的生化和信号转导的主要通路。利用实时定量PCR分析分别测定裂头蚴期（选取5个基因）和成虫期（选取5个基因）差异表达基因的真实转录水平,以验证RNA-seq的质量。6.SeFABP的生信分析通过在线软件ExPASy-Port Param分析FABP的等电点、分子质量、氨基酸组成等理化性质;利用ExPASy-Port Scale中K-D法对其进行亲水性/疏水性分析;使用TMHMM Serever对脂肪酸结合蛋白进行跨膜区分析;通过Signal P平台对FABP进行信号肽预测;利用Target P 1.1 Server进行亚细胞定位分析;蛋白质二级结构预测通过软件PSIPRED进行,在Phyre 2在线软件中分析FABP的三级结构。7.SeFABP的克隆表达鉴定以裂头蚴cDNA为模板,利用RT-PCR扩增SeFABP基因,将其胶回收纯化后,连接到克隆载体pMD19-T上,测序验证后连接到表达载体pMAL-c2x中,经过菌落PCR、质粒PCR和测序验证后,对诱导温度、IPTG浓度和诱导时间进行优化,在最佳条件下诱导表达,并采用亲和层析法纯化重组蛋白rSeFABP,用纯化后的rSeFABP蛋白免疫20只4～6周龄雌性BALB/c小鼠以制备抗rSeFABP免疫血清,通过ELISA和Western Blot检测免疫血清质量。利用TRIzol法提取虫卵期、裂头蚴期和成虫期RNA,反转录为cDNA后,进行RT-PCR和Real-time PCR,检测SeFABP基因在不同虫期的转录情况。收集裂头蚴和成虫新鲜虫体制成石蜡切片,使用抗rSeFABP免疫血清进行免疫荧光分析,以明确SeFABP在欧猬迭宫绦虫各虫期虫体的表达定位。8.rSeFABP与脂肪酸的结合测定使用棕榈酸（C16:0）和油酸（C18:1）进行重组蛋白rSeFABP的结合性能测试。2μg重组蛋白rSeFABP室温孵育30 min,每种脂肪酸按1:4的比例加入50 m M Tris-HCl,50 m M DTT,2 m M EDTA和5 m M Ca Cl2的缓冲液中。然后加入1μg/m L的梭菌蛋白酶（Arg C）,阴性对照中不加此酶,37℃下孵育,1 h和15 h时分别收集反应。用SDS-PAGE进行检测,以牛血清白蛋白（BSA）作为阳性对照。9.FABP的系统发育分析选择绦虫、吸虫及线虫的FABP序列进行亲缘关系比较,FABP序列通过Worm Base Parasite database数据库进行检索下载,并使用NCBI中TBLASTN工具进行序列的同源性检测。使用CLUSTALW对FABPs序列进行比对,然后将比对序列在MEGA软件中进行手工校对。分别采用最大简约和贝叶斯两种方法进行系统发育分析。最大简约分析在MEGA中进行,贝叶斯分析在Mr Bayes中进行。结果1.转录组组装及注释基于Illumina高通量测序,裂头蚴和成虫分别产生了43,544,371个（6,531,655,700个碱基）和42,579,785个（6,386,967,800个碱基）原始读长。经过滤分析,分别获得了43,151,508个（6,377,133,505个碱基,裂头蚴）和42,274,079个（6,264,471,514个碱基,成虫）高质量的纯净读长。根据所得的纯净读长,去除<200 nt的短序列后,所有样本（裂头蚴+成虫）共鉴定出241,564条转录本,平均长度为573 nt,N50为794 nt。大于500-1000 nt的转录本有38,647个（16%）,大于1000-1500 nt的转录本有12,695个（5.26%）。基于公共数据库采用BLAST法对241,564条转录本进行搜索,发现可以注释到的序列为67,412条（27.91%）,而注释不到的非同源序列占绝大对数（72.09%）。这67,412个可以注释到的蛋白质编码转录本被保留以供进一步分析。在可注释的67,412条序列中,Nr注释67,057条（99.47%）,COG注释20,753条（30.79%）,Swiss Prot注释18,540条（27.50%）,KEGG注释1,897条（2.81%）。在GO分析中,67,412个单基因被富集到三大GO类别:分子功能（MF）、细胞成分（CC）和生物过程（BP）的61个功能组中。所有注释的单基因被进一步进行COG类别分析,在25个COG类别中,T（信号转导机制）占6.35%（4,284/67,412单基因）,其次是R（一般功能预测）和O（翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣）。最后,对所有注释基因进行了KEGG分析,基于KEGG数据库,共有8,585个基因（12.74%）被归类为6种信号通路类别,分别对应到326条KEGG通路。2.比较转录组分析在裂头蚴期,高表达的基因包括:细胞质抗原基因,抗原多肽,肽酶抑制剂,库尼茨型丝氨酸蛋白酶抑制剂,半胱氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶抑制剂,ADP-核糖环化酶,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶,谷胱甘肽s转移酶,天冬氨酸转氨酶,衰老相关蛋白,动力蛋白和热休克蛋白。在成虫期,高表达基因包括转录因子蛋白质,脂肪酸结合蛋白,疏水配体结合蛋白,Na（+）/H（+）交换调节辅因子,脯氨酸顺反异构酶,棘球蚴病诊断抗原,磷酸甘油醛脱氢酶,亮氨酰氨肽酶,苹果酸脱氢酶,鸟氨酸转氨酶,钙网蛋白,凝溶胶蛋白,硫氧还蛋白,肌联蛋白,膜联蛋白,翻译延长因子和四次跨膜蛋白。而在两个时期均表现出高表达的基因包括一些细胞骨架管家基因（肌动蛋白、微管蛋白和核糖体蛋白）、代谢酶（焦磷酸酶/磷酸二酯酶、辅酶a、细胞色素c氧化酶）和信号蛋白（多泛素、钙结合蛋白）。裂头蚴期与成虫期有25,120个差异表达基因（DEG）,其中12,349个基因在裂头蚴期表达上调,12,771个基因表达下调。在DEGs中,有4,512个基因在裂头蚴中特异表达,4,339个基因在成虫中特异表达。GO和KEGG分析表明,裂头蚴上调基因的分子功能主要参与蛋白质降解和氨基酸代谢。成虫上调基因的分子功能主要与代谢活动相关。此外,qRT-PCR验证的表达水平与RNA-seq获得的表达水平一致,证实了RNA-seq结果的准确性。3.SeFABP序列分析SeFABP基因（Gen Bank:JQ919795）编码130个氨基酸,相对分子量为14.5k Da,p I为5.88,其不稳定指数为13.24,属于稳定蛋白;脂肪系数（Aliphatic）为88.46;总平均亲水性为-0.283。该蛋白不含跨膜区,无信号肽,在N端有疏水区。二级结构预测显示SeFABP有2个α螺旋,10个β折叠,13个无规则卷曲。三级建模结果显示β片层折叠成“桶”状结构,通过范德华力和疏水相互作用等可结合不同的疏水性配体,N端的2个α螺旋形成“帽子”样结构控制着疏水性配体的出入。4.SeFABP的分子鉴定将SeFABP基因导入克隆载体pMD19-T进行表达,重组菌落测序结果显示与Gen Bank上SeFABP的基因序列相似度为99%,表明pMD19-T-FABP重组克隆质粒构建成功。双酶切后将SeFABP基因连接到表达载体pMAL-c2X上,构建重组表达质粒,并进行双酶切和测序验证。经过诱导条件优化,加入0.5 m M IPTG,35℃诱导6 h后收集菌体进行SDS-PAGE,相比未诱导样品,在分子量为56.5 k Da（MBP标签）处出现一条明显的蛋白带,大小与理论预测一致,说明成功诱导表达出了目的蛋白rSeFABP。可溶性分析结果表明rSeFABP绝大部分在上清中表达。用纯化后的rSeFABP免疫小鼠制备抗rSeFABP免疫血清,间接ELISA法检测抗血清效价均在105以上,Western Blot检测表明抗rSeFABP小鼠血清能够特异性识别重组蛋白。RT-PCR和Real-time PCR结果显示,SeFABP在欧猬迭宫绦虫虫卵（Egg）、裂头蚴（Plerocercoid）、成虫（Adult）阶段均有转录,且不同虫期转录水平的差异具有统计学意义,其中成虫期转录水平最高,虫卵期转录水平次之,裂头蚴期最低。虫体切片免疫荧光实验结果显示在裂头蚴头节、体部横切、体部纵切,成虫幼节、成节、孕节及孕节子宫卵中均有绿色荧光,表明SeFABP在裂头蚴、成虫和虫卵期均有表达,且主要定位于欧猬迭宫绦虫卵壳、虫体皮层、实质组织及成虫子宫。5.rSeFABP的脂肪酸结合测定阳性对照组BSA未与脂肪酸结合时,加入或未加入Arg C酶的情况下,37℃孵育15 h后均出现明显降解,与脂肪酸结合后的BSA,在加入或未加入Arg C酶的情况下,37℃孵育15 h后出现微弱降解,提示BSA与脂肪酸结合形成了相对稳定的形式,但这种结合后的构象变化的稳定性是有限的。然而,对于重组蛋白rSeFABP,其与脂肪酸结合前后,是否加入Arg C酶均无明显变化,可能是原核表达折叠不当所致。6.系统发育模式最大简约法和贝叶斯法所得的系统发育树的拓扑结构基本一致。总的来说,整个寄生性蠕虫的FABP基因可以分为两个大分支:分支I和分支II,其中分支I由绦虫（Clade Cestode）和吸虫（Clade Trematode）两个子分支构成。分支II同样由两个子分支构成,其中一个子分支全部由线虫FABP组成,即线虫分支（Clade Nematode）;另一个子分支为混合分支（Clade Complex）,混合分支包含了线虫、吸虫和绦虫类群。系统发育分析结果表明:大多数脂肪酸结合蛋白家族成员具有保守性及物种特异性,但仍有一些处在分化的过程中。对于欧猬迭宫绦虫的13条脂肪酸结合蛋白序列,有4条插入到了混合分支,另外9条虽然在绦虫分支,但并没有聚在一起,分别插入到了4个不同的分支当中,表明欧猬迭宫绦虫的FABP序列多样化程度较高,可能存在多个不同的家族成员,且各家族成员处在不同的进化历程当中。结论1.蛋白酶相关基因在裂头蚴期高表达,脂类代谢相关基因和细胞骨架蛋白在成虫期高表达。裂头蚴期与成虫期的差异表达基因有25,120个,其中12,349个在裂头蚴期表达上调,12,771个在成虫期表达上调;裂头蚴期特异性表达基因有4,512个,成虫期特异性表达基因有4,339个。2.GO和KEGG分析表明裂头蚴期上调基因的分子功能主要与蛋白质降解和氨基酸代谢相关;成虫期上调基因的分子功能则主要与代谢活动相关。3.通过原核表达系统成功构建了欧猬迭宫绦虫SeFABP的重组表达质粒pMAL-c2X/SeFABP/BL21,并表达纯化了rSeFABP,SeFABP在欧猬迭宫绦虫虫卵期、裂头蚴期和成虫期均有表达,主要定位在卵壳、虫体皮层、实质组织及成虫子宫。4.欧猬迭宫绦虫的FABP序列多样化程度较高,可能存在多个不同的家族成员。