恶性肿瘤是人类的主要致死疾病之一。肿瘤的发生与细胞增殖失控、分化受阻，凋亡异常直接相关。近期研究发现一些转录因子在肿瘤中表达及活性均明显异常，可参与调控肿瘤细胞增殖、分化、血管生成等多种生物学功能，故而转录因子的研究已成为肿瘤防治研究领域的新热点。转录因子通常包括DNA结合区及一个或多个调控区，它们通过与DNA上的特异位点结合来发挥作用。其中，锌指蛋白是一类广泛存在于动植物及人类的DNA结合蛋白，也是最大的转录因子家族之一。　　 LOC51255基因全长716个碱基，编码蛋白长153个氨基酸，此蛋白含有RING指结构域，属于C3HC4型锌指蛋白。C3HC4型锌指是结合两个锌原子的，由40～60个氨基酸残基构成的特殊的锌指结构，该类型蛋白的共有序列为：C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-C-X2-C-X(4-48)-C-X2-C，其中X为任意氨基酸。RING指区域是一种蛋白质相互作用的区域，既往研究提示拥有RING指的蛋白普遍具有两方面功能：①可参与基因转录调控、DNA修复和重组、细胞转化及肿瘤抑制等多种生物过程；②RING指区域是E3泛素蛋白连接酶的重要活性区域，许多含有RING指结构域的蛋白都在泛素化途径中起关键作用，且目前普遍认为泛素-蛋白酶体途径与癌相关性脱调控有关，并参与癌性转化、肿瘤进展、免疫监控逃逸及药物抗性等重要病理生理过程。　　 通过生物信息学分析我们初步了解到LOC51255基因编码产物是一个含153个氨基酸，全长拥有一个RING指功能域的小分子蛋白质。该基因编码的具有RING指结构域的蛋白，在许多生物中都有同源蛋白存在，表明此结构域在生物进化中比较保守。氨基酸序列分析结果也显示该蛋白在进化中比较保守，可能对于维持生命有重要作用。功能分析提示LOC51255可能与肿瘤的发生发展有关，是一个具有肿瘤抑制作用的基因。这些结果为我们进一步研究LOC51255的功能提供了重要的理论依据和线索。　　 迄今为止，尚未检索到有关LOC51255功能研究的相关报道，尽管生物信息手段非常快速，能够提供一些有意义的信息，但据此得到的预测都有不确定性，不同的计算方式，可能得出不同的结果。为了阐明其确切功能，本课题拟从生物信息学分析入手，以该基因对肝癌细胞系SMMC-7721生物学行为及裸鼠移植瘤生长的影响为切入点，设计一系列实验，从多个角度对假设的功能进行验证，并通过观察其对肿瘤细胞生长、增殖及侵袭等的影响，最终了解本基因编码蛋白的生物学功能，并初步探讨其发挥作用的机制，从而为全面研究LOC51255的功能及在肿瘤中的作用奠定基础。　　 方法：　　 首先，用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中扩增获得目的基因，把目的基因连接到pMD18-T载体。经PCR、双酶切及测序鉴定后，将双酶切后的目的片段与真核表达载体pcDNA3.1(-)和pDsRed1-C3相连，得到重组质粒pcDNA3.1(-)/LOC51255和pDsRed1-C3/LOC51255，经双酶切及测序鉴定后，将重组质粒分别转染SMMC-7721、HepG2和293T细胞。其中转染后的SMMC-7721细胞采用G418筛选出稳定表达株，用于后续实验，转染后的HepG2和293T细胞用于亚细胞定位。　　 其次，用MTT法分别检测稳定表达LOC51255目的基因的SMMC-7721细胞(转LOC51255组)、只含空载体的SMMC-7721细胞(转空载体组)及未转染的SMMC-7721细胞(未处理组)的生长特性；同时用软琼脂克隆形成实验检测三组细胞的克隆形成能力；用流式细胞仪分析过表达LOC51255对细胞周期的影响；用Transwell法检测过表达LOC51255对细胞侵袭力的影响。　　 再次，将三组细胞分别注射至裸鼠右前肢腋部皮下，构建裸鼠移植瘤模型，观察移植瘤的生长速度，瘤体的重量、体积等情况。处死裸鼠后，进行瘤体组织的HE染色及免疫组织化学检测。　　 最后，以细胞周期蛋白为靶点，从mRNA水平检测转染前后细胞周期蛋白B1、D1、E1及E2的表达变化，初步探讨LOC51255基因影响肿瘤细胞的作用机制。　　 结果：　　 1.成功构建重组质粒pcDNA3.1(-)/LOC51255和带有红色荧光标记的重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255。　　 2.用脂质体法将pcDNA3.1(-)/LOC51255转染肝癌细胞系SMMC-7721，通过G418筛选获得稳定转染的肝癌细胞之后，再用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA及蛋白水平鉴定。结果表明转LOC51255组中LOC51255的表达量明显增高，提示成功构建稳定表达LOC51255的肝癌细胞株。　　 3.用同样方法将pDsRed1-C3/LOC51255转染HepG2和293T细胞株，经荧光显微镜观察发现目的基因主要表达于细胞浆；同时用免疫组织化学法分析LOC51255在肝癌组织细胞中的定位，细胞免疫荧光技术分析LOC51255在Chang肝细胞和SMMC-7721细胞中的定位，结果均证实LOC51255主要定位于细胞浆。　　 4.采用MTT法检测三组细胞的生长特性，结果表明与转空载体组和未处理组相比，过表达LOC51255能明显抑制肿瘤细胞的增殖。　　 5.软琼脂克隆形成实验显示转LOC51255组，其克隆形成能力明显低于两对照组，且伴有SMMC-7721细胞克隆形态的明显改变。证实LOC51255能抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成能力、并可能降低肿瘤细胞的恶性程度。　　 6.Transwell实验显示过表达LOC51255的稳定细胞株的侵袭能力明显降低，提示LOC51255可降低肿瘤细胞的侵袭性。　　 7.用饥饿法使各组细胞周期同步化后，流式细胞仪分析结果发现，过表达LOC51255可延缓SMMC-7721细胞株从G1期进入S期。提示LOC51255抑制细胞生长的机制可能与其影响细胞周期的进展有关。　　 8.将三组细胞分别注射至裸鼠右前肢腋部皮下，成功构建裸鼠移植瘤模型，经观察发现注射转LOC51255组细胞的裸鼠，比注射转空载体组及未处理组细胞的裸鼠的瘤体生长速度慢、瘤体重量轻、体积小，且恶性程度低。　　 9.移植瘤组织石蜡切片HE染色结果显示：注射转LOC51255组细胞的裸鼠，其移植瘤组织异形性小，细胞核变小，胞浆增多，细胞形态向正常细胞方向逆转。　　 10.免疫组织化学分析结果显示：注射转LOC51255组细胞的裸鼠移植瘤组织中LOC51255蛋白的表达量明显增高，证实LOC51255蛋白的确在裸鼠移植瘤中得以表达并抑制了移植瘤的生长、增殖，降低了肿瘤细胞的恶性程度。　　 11.通过RT-PCR检测，发现转染LOC51255基因的肝癌细胞中，其cyclin D1表达明显降低。提示LOC51255基因对肝癌细胞生长的影响可能与抑制cyclin D1的表达有关。　　 结论：过表达LOC51255基因可抑制SMMC-7721细胞的增殖、降低其克隆形成能力、侵袭力以及裸鼠成瘤能力，并使其恶性程度下降，表型向正常肝细胞逆转，从而为肝癌的防治提供了新的思路和干预靶点；初步证实LOC51255基因可能通过抑制cyclin D1的表达，延缓细胞从G1期进入S期而起作用，为更深入的机制研究奠定了良好基础。