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绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)引起绵羊和山羊发生间质性肺炎的常见病原。羊感染后在临床上主要表现为呼吸障碍、腹泻、消瘦、生长发育迟缓等慢性非进行性肺炎症状,MO已成为影响养羊业发展的重要病原之一。自1963年国外首次分离MO后,我国在1978年从国外引进种羊体内发现该病原,随后相继在全国各地有MO感染的病例报道。新疆是我国养羊业的主要地区,该病在羔羊上的发病率和死亡率较高。目前,尚无有效商品化疫苗来预防绵羊支原体肺炎的发生。因此,在新疆地区开展MO的分离鉴定,应用分离的主要流行株研发预防该病的油佐剂灭活疫苗具有重要的现实意义。本论文开展的主要工作和研究结果如下:1.绵羊肺炎支原体塔城流行株的分离与鉴定从新疆塔城地区采集的疑似MO感染的病死羊肺脏25份病料,用支原体培养基进行MO的分离与鉴定研究。结果成功分离得到15株支原体疑似分离株,分离株菌落呈典型的乳头状,菌体呈多形性。用Dienes染液染色,菌落中心被染成深蓝色、边缘染色浅。14株支原体均水解葡萄糖、吸附红细胞,只有1株支原体水解尿素且不吸附红细胞。15株支原体均使美兰牛乳褪色和发生溶血。通过对分离株16S r RNA基因序列PCR扩增、测序和遗传进化分析,发现14株分离株与Y98株核苷酸同源性98.82%-100%之间,并且MO SC01株和Y98株聚为一支,证实14个分离株均为绵羊肺炎支原体。2.绵羊肺炎支原体塔城分离株抗原基因的克隆、遗传变异分析及表达根据MO SC01株基因组序列设计特异性引物,分别通过PCR扩增HSP 70、黏附素、溶血素A和溶血素C四个基因、克隆测序后进行遗传进化分析,并对重组蛋白HSP70进行免疫性研究。成功克隆了HSP70、黏附素、溶血素A和溶血素C四个基因,大小分别为747 bp、3426 bp、777 bp和1239 bp。MO塔城分离株S3与SC01相比,HSP70基因核苷酸同源性为85.24%,氨基酸同源性为83.24%,有64处核苷酸发生变异,24处氨基酸位点发生突变。黏附素基因核苷酸同源率为93.56%,氨基酸的同源性为92.19%,有180个核苷酸位点发生变异,导致62氨基酸发生突变。溶血素A基因核苷酸同源性为95.24%,氨基酸同源性为93.64%,有32个核苷酸位点发生变异,20个氨基酸位点发生突变。溶血素C基因核苷酸同源性为89.31%,氨基酸同源性为85.23%,有45处核苷酸发生突变,23氨基酸位点发生突变。遗传进化树分析显示,MO塔城分离株与MO SC01株、猪肺炎支原体J、猪肺炎支原体232亲缘关系较近。抗原表位分析结果发现,MO塔城分离株HSP 70、黏附素、溶血素A和溶血素C抗原与SC01株相应的抗原表位存在一定的差异。SDS-PAGE和Western blot分析显示,用大肠杆菌中表达的重组HSP70分子量为53 k Da,可与抗MO多克隆抗体发生反应,诱导小鼠产生MO抗体,具有良好的免疫原性。3.绵羊肺炎支原体油佐剂灭活疫苗的制备及免疫原性研究以MO塔城分离株S3作为菌种,培养MO生长滴度达到1×109 CCU/m L时进行收菌,浓缩20倍,抗原稀释为0.5mg/m L和0.25mg/m L;甲醛37℃灭活48 h,再与油佐剂1:1混匀乳化,制备油佐剂灭活疫苗,并对制备的灭活疫苗进行无菌和安全性检测。选择MO抗体阴性的健康绵羊27只,分为F1、F2和对照组3组,每组9只。F1组和F2组分别经颈部皮下接种抗原浓度为0.5mg/m L和0.25mg/m L的疫苗2m L/只,免疫2次,每次间隔15 d;对照组羊只按照相同剂量和方法注射生理盐水。分别在第0、15、30、45、60、75、90和105d采集血液,分离血清进行间接血凝抗体效价测定。免疫后90d,用S3菌株进行攻毒试验,测量体温、观察临床症状,并于攻毒后35d剖检,观察病理变化。结果显示,F1和F2试验组的羊只经两次免疫后血液中均产生了抗MO特异性抗体,在第45d时抗体效价在1:16-1:64之间,而对照组抗体效价均为阴性。攻毒保护试验结果表明,F1和F2试验组免疫保护率均为88.9%(8/9),而对照组羊100%发病。进一步分析发现,攻毒前间接血凝抗体效价≥8的羊只可获得免疫保护,证实该灭活疫苗具有较好的免疫原性。