绒毛外滋养细胞入侵母体子宫组织,引起母体螺旋血管重构,对胎盘发育和妊娠过程的顺利进行必不可少。与肿瘤不同的是,间质滋养细胞侵袭深度不超过蜕膜和子宫肌层的外三分之一,滋养细胞侵袭程度是由滋养层细胞和母体以时空的方式精确调控的。滋养细胞侵袭过程失衡会导致各种疾病,若绒毛滋养层细胞过度增殖并向子宫基质纵向侵袭及远处转移,则可导致侵袭性葡萄胎、绒癌等滋养细胞肿瘤的发生。滋养层细胞侵入调控机制的研究,有望为肿瘤浸润转移的机理研究提供新的突破。细胞过度增殖是肿瘤发生的基础,相关研究发现,恶性肿瘤侵袭转移与细胞外基质的过度降解密不可分。近年来,随着人们对滋养细胞侵袭调控过程的深入研究,越来越多的侵袭调控因子及信号通路被陆续发现参与滋养细胞侵袭过程。其中基质金属蛋白酶及其抑制剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂及其抑制剂是影响滋养细胞侵袭程度的重要调节因子,可通过降解细胞外基质蛋白,参与滋养细胞侵入调控过程。信号传导及转录激活因子3及C-Jun氨基末端激酶是信号传导途径中重要的核转录因子,已有文献报道,活化的信号传导及转录激活因子3及C-Jun氨基末端激酶可直接或间接地参与调控绒癌细胞增殖和侵润过程。但目前对滋养细胞侵入调控过程中引起这些侵袭调控因子及信号激酶变化的上游效应因子我们知之甚少。F10基因是课题组前期通过抑制性消减杂交法从正常早孕绒毛膜组织与葡萄胎组织中分离鉴定出一种功能未明的新基因。F10基因在葡萄胎组织、侵蚀性葡萄胎、绒癌中均阳性表达且依次增强,提示F10与滋养细胞肿瘤的发生发展及侵袭和转移有关。通过采用GFP作为标记物来观察F10基因表达蛋白在细胞中的分布和定位,结果表明在细胞分裂中期,F10基因定位于细胞核,这可能与纺锤体的形成有关；在细胞分裂间期,F10出核至细胞器,作用于微管蛋白,这提示F10基因可能是参与遗传信息调控的转录因子,因此我们初步推测F10基因不仅与滋养细胞肿瘤密切相关,还有可能作为一种癌基因参与某些肿瘤的发生发展和转移。那么F10基因是否可通过影响基质金属蛋白酶等侵袭相关因子及信号激酶的表达来参与滋养细胞肿瘤的侵袭和转移?目前关于F10在滋养细胞肿瘤发病机制中的作用尚无研究及报道。本研究采用基因转导技术,分别构建真核质粒表达载体及RNAi慢病毒载体,设计并构建重组体,将重组体分别转染到绒癌细胞系,经筛选及包装,获得F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞,并用F10基因稳定过表达和沉默绒癌细胞株制备绒癌裸鼠皮下肿瘤模型,模拟人体内环境,在活体动物上直观地观察F10基因过表达和基因沉默对绒癌细胞系成瘤性的影响；之后收集裸鼠皮下绒癌组织,分别检测不同组绒癌组织中相关周期蛋白的表达水平,揭示F10与滋养细胞增殖、凋亡的关系,同时检测不同组间基质金属蛋白酶及其抑制剂及纤溶酶原激活物抑制剂等侵袭相关因子的表达水平,探讨F10基因在绒癌细胞侵入调控中的作用。最后,通过检测不同组绒癌组织中相关信号激酶的表达差异,研究F10基因干预后绒癌细胞中信号蛋白酶的活性变化。以上研究对探讨滋养细胞肿瘤的发病机制具有重要意义,并为将来发展基于新基因F10的肿瘤防治措施提供理论支持。第一章滋养细胞肿瘤动物模型的成功构建目的为探讨葡萄胎病理相关新基因F10对绒癌细胞系成瘤性的影响,我们通过基因转染及基因沉默技术,获得F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞系JEG-3、BEWO,并用F10基因稳定过表达和沉默绒癌细胞株制备裸鼠绒癌动物模型,观察裸鼠皮下肿瘤生长情况,并通过检测成瘤组织中F10的表达水平,以验证F10蛋白在过表达组、沉默组及正常对照组中的表达差异,从而确认动物模型构建的成功,初步探讨F10基因与绒癌细胞致瘤性的关系。方法针对F10基因分别设计并构建F10基因稳定过表达及沉默的绒癌细胞JEG-3、JAR单克隆细胞和F10沉默处理的BEWO细胞,而未处理的JEG-3、JAR、 BEWO细胞作为正常对照组。经体外培养后,收集对数生长期细胞,制备细胞悬液。将80只裸鼠随机均分为JEG-3 F10过表达组、JEG-3对照组和JEG-3 F10沉默组；JAR F10过表达组、JAR对照组和JAR F10沉默组；BEWO对照组和BEWO F10沉默组(n=10),以75%乙醇消毒裸鼠局部皮肤,1ml无菌注射器吸取预先制备的细胞悬液(0.2ml/只,含细胞5×107个)接种于动物颈背部皮下。观察皮下成瘤情况,记录裸鼠肿瘤发生时间；计算各组裸鼠的成瘤率；绘制在体肿瘤生长曲线；细胞接种5周后处死小鼠,取瘤组织称重,比较各组瘤体重量。收集各组瘤体组织,通过免疫组化法及Western blot法检测F10分别在JEG-3、JAR, BEWO各组肿瘤组织中的表达情况。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、裸鼠皮下肿瘤的成瘤时间、成瘤率及瘤体重量1.1 JEG-3三组成瘤率均为100%(10/10)。单因素方差分析显示：三组的成瘤时间(分别为7±2.49d、6.3±0.67d、6.2±0.78d)无统计学差异(F=0.781,P=0.468)。三组肿瘤重量(分别为571.1±221.10mg、354.5±116.23mg、 136.2±66.25mg),存在统计学差异(F=21.199, P=0.000)。JEG-3 F10过表达组体重均较JEG-3 F10沉默组、JEG-3对照组重,JEG-3对照组较JEG-3 F10沉默组重。1.2 JAR三组成瘤率均为100%(10/10)。单因素方差分析显示：三组的成瘤时间(分别为4.0±1.07d、4.4±1.07d、4.6±1.35d)无统计学差异(F=0.097,P=0.908)。三组肿瘤重量(分别为607.49±216.19mg、423.87±74.75mg、 270.73±81.53mg),存在统计学差异(F=14.462, P=0.000)。JAR F10过表达组体重均较JAR F10沉默组、JAR对照组重,JAR对照组较JAR F10沉默组重。1.3 BEWO两组成瘤率均为100%(10/10)。两独立样本t检验结果显示:两组的成瘤时间(分别为4.5±1.43d、4.1±1.29d)无统计学差异(t=0.657,P=0.520)。两组肿瘤重量(分别为118.50±22.53mg、85.90±20.41mg),存在统计学差异(t=-3.339,P=0.004)。BEWO对照组较BEWO F10沉默组重。2、裸鼠皮下肿瘤在体生长速度分析2.1 JEG-3三组在不同时间点的成瘤体积进行重复测量方差分析显示,组间主效应(不同时间的数据与各组的数据)差异有统计学意义(F=136.311,P=0.000)。将各组数据采用单因素方差分析发现,JEG-3 F10沉默组、JEG-3对照组、JEG-3 F10过表达组在不同时间点的成瘤体积差异显著(F=68.548,P=0.000),时间与组间的交互效应差异显著(F=16.011,P=0.000)。LSD-t多重比较显示,JEG-3对照组肿瘤在体生长速度明显快于JEG-3 F10沉默组,JEG-3 F10过表达组在体生长速度明显快于JEG-3对照组,差异均有统计学意义(P=0.000)。2.2 JAR三组在不同时间点的成瘤体积进行重复测量方差分析显示,组间主效应(不同时间的数据与各组的数据)差异有统计学意义(F=163.623,P=0.000)。将各组数据采用单因素方差分析发现,JAR F10沉默组、JAR对照组、JAR F10过表达组在不同时间点的成瘤体积差异显著(F=37.639,P=0.000),时间与组间的交互效应差异显著(F=8.133, P=0.000)。LSD-t多重比较显示,JAR对照组肿瘤在体生长速度明显快于JAR F10沉默组,JAR F10过表达组在体生长速度明显快于JAR对照组,差异均有统计学意义(P=0.000)。2.3 BEWO两组在不同时间点的成瘤体积进行重复测量方差分析显示,组间主效应(不同时间的数据与各组的数据)差异有统计学意义(F=114.995,P=0.000)。将各组数据采用单因素方差分析发现,BEWO F10沉默组、BEWO对照组在不同时间点的成瘤体积差异显著(F=16.869,P=0.001),时间与组间的交互效应差异无统计学意义(F=2.618,P=0.093)。LSD-t多重比较显示,BEWO对照组肿瘤在体生长速度明显快于BEWO F10沉默组,差异均有统计学意义(P=0.000)。3、F10在各组成瘤组织中的表达验证3.1免疫组化法检测F10在JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的表达情况3.1.1免疫组化结果显示,F10在JEG-3 F10过表达组、F10沉默组、正常对照组肿瘤组织中的表达存在统计学差异((F=15.405,P=0.008)。与正常对照组相比,JEG-3 F10过表达组F10蛋白表达水平明显增强(P<0.05),JEG-3 F10沉默组F10蛋白表达水平降低(P<0.05)。3.1.2免疫组化半定量结果显示,F10在JAR F10过表达组、正常对照组、F10沉默组肿瘤组织中的表达水平依次降低,差异具有统计学意义(F=144.644,P<0.001)。3.1.3对BEWO F10沉默组、正常对照组肿瘤组织行免疫组化验证,半定量结果显示,与对照组相比,F10沉默组中F10的表达水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.2 Western blot检测F10在JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的表达情况3.2.1对JEG-3三组肿瘤组织行Western blot验证,结果提示F10蛋白条带灰度值在过表达组强度最高,其次分别为正常对照组及F10沉默组,差异均有统计学意义(P<0.001)。3.2.2 Western blot半定量结果显示,与正常对照组相比,JAR F10过表达组F10表达水平明显增强,JAR F10沉默组F10表达水平显著降低(P<0.05)。3.2.3 Western blot结果显示,F10在BEWO F10沉默组及正常对照组中存在表达差异,F10蛋白条带灰度值在F10沉默组强度较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论实验结果显示,与正常对照组相比,经F10过表达处理的绒癌细胞JEG-3、JAR成瘤后肿瘤的生长速度明显增快,瘤体重量增加,经F10沉默处理的绒癌细胞JEG-3、JAR、BEWO成瘤后的肿瘤生长速度明显减慢,瘤体重量减轻,提示F10基因可能与绒癌细胞系的增殖调节有关,可增强绒癌细胞系在裸鼠体内的致瘤性。F10过表达及沉默组与正常对照组的成瘤率及成瘤时间无统计学差异,说明各组接种细胞数量一致(排除人为误差)。通过免疫组化及Western bolt检测肿瘤组织中F10的表达差异,实验结果提示,与正常对照组相比,JEG-3、JAR F10过表达组中F10蛋白表达增加,JEG-3、JAR、BEWO沉默组中F10蛋白表达显著降低,提示各组成瘤组织中F10表达差异与经F10过表达及沉默处理的绒癌细胞一致,从而确认JEG-3、JAR、BEWO三种绒癌细胞系制备裸鼠皮下肿瘤模型成功。第二章F10基因干预前后滋养细胞肿瘤增殖活性的变化目的如前所述,经F10过表达和沉默处理后的绒癌细胞系JEG-3、JAR、BEWO制备裸鼠皮下成瘤动物模型,在F10过表达组、对照组及F10沉默组中F10蛋白的表达差异已得到验证,动物模型构建成功。F10过表达处理的绒癌细胞成瘤后肿瘤生长速度加快,而F10沉默组的绒癌细胞成瘤后肿瘤生长速度显著降低,说明F10可促进绒癌细胞的增殖,滋养细胞过度增殖是影响其侵润深度的重要因素。那么,F10是否可通过调节其增殖及凋亡而改变滋养细胞的侵润能力?本实验拟通过检测成瘤后组织中相关周期蛋白的表达差异,进一步探讨其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法动物模型构建成功后,收集各组肿瘤组织,通过免疫组化法及Western blot检测以上获得的动物模型肿瘤组织中PCNA、CyclinE、CDK、Caspase-3蛋白的表达差异。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD-t检验：两组间比较采用完全随机设计资料的两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、免疫组化法检测PCNA、CyclinE1、CDK、Caspase-3蛋白在JEG-3、JAR、 BEWO各组肿瘤组织中的表达情况1.1 JEG-3.JAR两种绒癌细胞形成的肿瘤组织免疫组化结果显示,CyclinE1、CDK在F10沉默组、对照组、F10过表达组中的表达水平依次增强(P<0.001),相反,Caspase-3在F10沉默组中表达最强,其次是对照组、F10过表达组,差异均有统计学意义(P<0.001)。1.2 BEWO组肿瘤组织的免疫组化结果显示,在F10沉默组中,CyclinE1、CDK的表达水平显著低于正常对照组(P<0.001),Caspase-3蛋白的表达显著高于对照组(P<0.001)1.3我们还分别对JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的PCNA蛋白进行免疫组化染色,半定量结果显示,F10过表达组、对照组及F10沉默组中其表达水平无统计学差异(P>0.05)。2、Western blot检测PCNA、CyclinE1、CDK、Caspase-3蛋白在JEG-3、JAR、 BEWO各组肿瘤组织中的表达情况2.1 JEG-3、JAR绒癌细胞皮下成瘤组织中Western blot检测结果与免疫组化结果一致,CyclinE1、CDK在F10过表达组中的表达强度最高,其次是对照组、F10沉默组,差异均有统计学意义(P<0.001)；相反,F10沉默组中Caspase-3条带粗且强度高,半定量结果显示,Caspase-3在F10沉默组、对照组、F10过表达组表达强度依次递减,差异均有统计学意义(P<0.001)。2.2 BEWO组肿瘤组织Western blot结果显示,F10沉默组CyclinE1、CDK条带细且强度低,与对照组相比,沉默组CyclinE1、CDK蛋白表达显著下调(P<0.001)。而F10沉默组Caspase-3的表达强度显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。2.3 Western blot分别对JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的PCNA蛋白进行检测,半定量结果显示,F10过表达组、对照组、F10沉默组中PCNA表达强度无统计学差异(P>0.05)。结论JEG-3.JAR.BEWO三种绒癌细胞构建动物模型,探讨F10基因对绒癌细胞增殖及凋亡的影响。实验结果显示,F10过表达组的绒癌细胞增殖标记物表达增多,凋亡标记物表达减少,而F10沉默组则凋亡标记物增多,提示F10基因具有促进绒癌细胞增殖、抗凋亡作用。第三章滋养细胞肿瘤中F10基因干预后侵袭相关蛋白酶的表达目的前述研究证实经F10过表达和沉默处理后的绒癌细胞系JEG-3.JAR.BEWO制备裸鼠皮下成瘤动物模型中,F10过表达组的绒癌细胞增殖增加,凋亡减少,而F10沉默组的绒癌细胞凋亡增多,进而说明F10基因具有促进绒癌细胞增殖、抗凋亡作用。绒癌的发生与滋养细胞的过度侵袭和浸润密切相关,细胞的过度增殖是侵袭的前提,细胞外基质和基底膜的破坏是肿瘤侵袭和转移的重要原因之一。基质金属蛋白酶MMPs及其抑制剂的活性与滋养层细胞的侵袭行为存在直接联系。由此我们推测F10是否可通过调节MMPs及其抑制剂等侵袭相关因子进而影响绒癌细胞的侵袭行为?本实验拟通过检测各组皮下肿瘤组织中侵袭相关蛋白的表达差异,进一步探讨F10与肿瘤侵袭和浸润的关系。方法动物模型构建成功后,收集各组肿瘤组织,通过免疫组化法及Western blot检测以上获得的动物模型肿瘤组织中MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19.TIMP-1、-3、PAI-1等蛋白表达差异情况。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用完全随机设计资料的两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、免疫组化法检测MMP-2、-8、-9.-11、-15、-16、-19、TIMP-1、-3、PAI-1、在JEG-3、JAR, BEWO各组肿瘤组织中的表达情况1.1免疫组化染色检测JEG-3及JAR两种绒癌细胞皮下成瘤组织,结果显示：MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19在F10沉默组、正常对照组、F10过表达组肿瘤组织中的表达水平逐渐增高(P<0.05)。TIMP-1、-3、PAI-1在F10沉默组、正常对照组、F10过表达组肿瘤组织中的表达水平逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。1.2 BEWO组肿瘤组织的免疫组化结果显示,F10沉默组中的MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19显著低于正常对照组(P<0.05),TIMP-1、-3、PAI-1则显著高于对照组(P<0.05),差异均有统计学意义。2, Western blot检测MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19、TIMP-1、-3、PAI-1在JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的表达情况2.1 JEG-3及JAR两组肿瘤组织Western blot检测结果中,F10过表达组MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19条带粗且强度高,半定量结果显示,与对照组相比,上述蛋白的表达显著上调(P<0.05),F10沉默组MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19的表达显著下调(P<0.05)。 TIMP-1、-3、PAI-1在F10过表达、对照组、F10沉默组中的表达强度依次增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.2 Western blot检测BEWO组肿瘤组织,半定量结果显示：与对照组相比,F10沉默组MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19蛋白的表达下调(P<0.05)；TIMP-1、-3、PAI-1蛋白的表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在JEG-3、JAR、BEWO三种绒癌细胞成瘤组织中,F10过表达组的MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19等促侵袭蛋白显著增加,TIMP-1、-3、PAI-1等抑制侵袭因子显著减少,而在F10沉默组结果刚好相反,这提示F10可通过上调MMP-2、-8、-9、-11、-15、-16、-19的表达,下调TIMP-1、-3、 PAI-1表达,促进绒癌细胞侵袭和转移。第四章滋养细胞肿瘤中F10基因干预后信号激酶的活性目的上述研究已证实经F10过表达和沉默处理后的绒癌细胞系JEG-3、JAR BEWO制备裸鼠皮下成瘤动物模型中,上游基因F10具有促进绒癌细胞增殖,抑制其凋亡的作用,同时可通过上调基质金属蛋白酶的表达,下调基质金属蛋白酶抑制剂及纤溶酶原活化物抑制剂的表达,促进绒癌侵袭和浸润。本实验拟通过检测各组肿瘤组织中相关信号激酶的活性差异,进一步研究F10促进绒癌细胞侵袭和浸润的具体作用机制。方法动物模型构建成功后,收集各组肿瘤组织,通过免疫组化法及Western blot检测以上获得的动物模型肿瘤组织中P-STAT3、P-JNK信号酶蛋白表达差异情况。所有数据资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用完全随机设计资料的两独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果1、免疫组化法检测P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的表达情况1.1免疫组化染色检测JEG-3、JAR绒癌细胞皮下成瘤组织,半定量结果显示,与正常对照组相比,F10过表达组及F10沉默组中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表达均显著增加(P<0.001)。1.2 BEWO组肿瘤组织的免疫组化结果显示,在F10沉默组中,P-STAT3、 P-JNK蛋白激酶的表达水平显著低于正常对照组。2、Western blot检测P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR、BEWO各组肿瘤组织中的表达情况2.1 JEG-3、JAR绒癌细胞皮下成瘤组织中Western blot检测结果与免疫组化结果一致,F10过表达组及F10沉默组中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表达水平均高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。2.2 Western blot检测BEWO组肿瘤组织,半定量结果显示,与正常对照组相比,F10沉默组中P-STAT3、P-JNK蛋白激酶表达显著降低(P<0.001)。结论经F10过表达及沉默处理的JEG-3、JAR、BEWO绒癌细胞制备裸鼠皮下肿瘤,免疫组化及Western blot法检测P-STAT3及P-JNK的表达差异,结果显示,F10过表达的P-STAT3、P-JNK在JEG-3、JAR绒癌细胞系成瘤组织中的表达显著上调,而在BEWO细胞的F10沉默组中显著下调,提示F10可能通过STAT3及JNK信号通路影响绒癌细胞的增殖,进而参与调控其侵润行为。结合前述研究,提示F10基因不仅可影响绒癌细胞的增殖和凋亡,并通过改变基质金属蛋白酶等侵入相关蛋白来促进绒癌细胞侵润,还可能通过STAT3及JNK信号激酶参与调控滋养细胞侵袭行为。