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我国生产供应的鲜食柑橘种类主要为中熟,其熟期布局严重不均衡。分散品种熟期布局,扩大果品供给期,是柑橘产业发展的关键。此前,关于影响柑橘熟期的糖酸合成分解途径、类胡萝卜合成分解途径等已有较深入的研究,但关于影响其成熟的基因的功能探讨仍较少。探究影响柑橘果实成熟的基因的表达与调控,有利于进一步挖掘其成熟过程在分子水平的机理,对调整柑橘果实熟期有重大的作用。本实验以2个柑橘果实熟期相关基因Cs MYB21与Cs MYB77为对象,以‘奉节72-1’(WT)脐橙与其晚熟芽变‘奉节晚橙’(MT)为试材,通过转化Mic-Tom番茄,初步确定了基因Cs MYB21与Cs MYB77的功能。主要研究结果如下:1、基因克隆与生物信息学分析:分别克隆2个转录因子在WT和MT中的基因全长与启动子片段,且分析了其启动子区顺式作用结合元件。利用Clustalx 1.81和Mega 5.1软件对2个基因氨基酸序列和拟南芥、番茄中MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族进行进化树分析,发现Cs2g27940与番茄Solyc02g067760.2.1和拟南芥AT3g27810(ATMYB21),Cs3g23950与番茄Solyc04g079360.1.1和AT3g50060(ATMYB77)亲缘关系最近,分别命名Cs2g27940、Cs3g23950为Cs MYB21、Cs MYB77。预测分析2个转录因子的蛋白质大小、等电点、保守结构域等一级结构。2个目的基因的基因全长和其启动子序列在WT和MT中均无发生突变,启动子的顺式结合元件中均含有大量与光信号以及植物激素信号途径相关的元件,说明其可能通过参与或影响光信号、激素信号途径来影响果实的发育和成熟。2、转录因子转录活性检测:克隆2个基因的CDS区,分别构建亚细胞定位载体和转录激活活性载体。通过将Cs MYB21::YFP和Cs MYB77::YFP注射本氏烟草下表皮中发现,两种融合蛋白均在细胞核中表达。将融合表达载体p GBKT7-Cs MYB21和p GBKT7-Cs MYB77分别转化酵母菌株AH109后在不完全培养基上培养,均正常生长。结果证明,Cs MYB21和Cs MYB77均是典型的MYB家族转录因子。3、表达模式分析:利用q RT-PCR测定了2个转录因子在果实生长不同阶段及各组织中的表达量。结果显示,Cs MYB77主要在果实发育早期表达,Cs MYB21主要在发育后期表达;且2个目的基因在WT和MT两个材料的各发育阶段和各组织中表达差异较大。由此推测两个基因可能与果实成熟相关。4、转录因子功能验证:构建2个目的基因的超表达载体并应用农杆菌介导方法转化Mic-Tom番茄,鉴定获得超表达目的基因的株系并从中各筛选6个株系统计性状。结果发现,超表达Cs MYB77基因的果实破色时间延长,说明其可能负调控果实成熟;而超表达Cs MYB21基因的植株萌芽率较低,落花严重,说明其可能参与调控花的发育。