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心力衰竭是心血管疾病发展的严重和终末阶段,病死率较高,是严重影响人类健康的心血管疾病之一。近年来,多项研究发现,可溶性生长刺激表达基因蛋白-2(Soluble growth stimulation expressed gene 2,sST2)在心力衰竭患者中明显升高,其与心肌纤维化反应有直接关联,可反映和预测心力衰竭患者心肌纤维化和心室重塑程度,且不易受年龄、性别及肾功能等因素的影响,是评价心力衰竭的理想指标,并且已逐渐成为心力衰竭预后的新型生物标志物。因此,建立一种灵敏检测sST2水平的方法不仅对于临床上心力衰竭的诊断及预后评估具有重要的意义,同时也有助于sST2表达调控的实验研究。鉴于双抗体夹心ELISA具有敏感度高、特异性强及操作简便等优点,所以本研究拟建立一种用于检测sST2的双抗体夹心ELISA检测方法。获得高质量的单克隆抗体是决定双抗体夹心ELISA检测方法特异性和灵敏度的关键。目前制备抗体常用的方法是以全长蛋白作为免疫来获得相应抗体,通过这种方法获得可用于配对的抗体有一定的难度,可能需要进行大量的筛选工作才有可能获得相对满意的抗体对,所以针对以上的问题我们设计了两种单抗制备策略。首先我们利用目前常用的生物信息学软件对sST2的B细胞线性抗原表位进行预测,筛选得到一些潜在的在空间结构上互不干扰的线性抗原表位,设计了三个含有两至多个抗原表位的sST2肽段(sST2F1、F2及F3)和两个B细胞线性抗原表位肽(sST2 EP1及EP2)。然后考虑到所设计的肽段和B细胞线性抗原表位分子量小,免疫原性弱且不易纯化制备,为此我们利用表达量高、易纯化的谷胱甘肽巯基转移酶GST作为肽段的免疫携带载体来呈递肽段,利用免疫原性强的乙肝病毒核心蛋白HBcAg和腺病毒作为表位肽的免疫携带载体来呈递表位肽,通过联合免疫及交叉筛选方法,利用杂交瘤技术制备针对人sST2肽段和表位肽的单克隆抗体,并利用所得到的抗体建立sST2的双抗体夹心ELISA检测方法。本课题将从以下两个方面展开研究。1.用于制备人sST2肽段、表位肽的单克隆抗体所需的免疫原及筛选抗原的制备与纯化1)sST2抗原表位预测:利用目前常用的生物信息学软件对sST2的B细胞线性抗原表位进行预测,筛选出潜在的在空间结构上互不干扰的抗原表位,并利用其设计了三个sST2肽段和两个B细胞线性抗原表位肽。2)制备抗sST2肽段、表位肽的单克隆抗体所需的免疫蛋白及筛选蛋白的制备:利用原核表达系统和Ni-NTA亲和层析法成功纯化制备sST2全长原核蛋白(sST2-6His)、sST2 肽段融合 GST 标签的融合蛋白(GST-sST2F1-6His、GST-sST2 F2-6His 及 GST-sST2 F3-6His)、sST2 F1-F2 肽段融合 Grn E 标签的融合蛋白(Grn E-sST2 F1-6His、Gm E-sST2 F2-6His)、sST2 F3 肽段融合 His 标签的融合蛋白(sST2 F3-6His)、sST2表位肽融合HBcAg的融合蛋白(HBcAg-sST2 EP1-6His、HBcAg-sST2EP2-6His)及 sST2 表位肽融合 GrnE 的融合蛋白(Grn E-sST2 EP1-6His、Grn E-sST2 EP2-6His)。3)E1区携带分泌型HBcAg-sST2表位肽融合蛋白且Hexon区经sST2表位肽修饰的重组腺病毒 pAd5/E1-CMV-HBcAg-sST2 EP1-2/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-sST2 EP1-2的制备与纯化:首先将设计的两个sST2的表位肽均分别连入腺病毒E1区穿梭载体pShuttle-E1/H1H2-HBcAg与腺病毒骨架载体pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon-HVR5-LacZ 中,经过酶切鉴定和测序,获得E1区携带分泌型HBcAg-sST2 EP1-2融合蛋白的腺病毒穿梭载体pShuttle-E1/H1H2-HBcAg-sST2 EP1-2和Hexon区经sST2表位肽修饰的腺病毒载体pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon-HVR5-sST2 EP1-2。然后,将 ScaI 线性化的 pShuttle-E1/H1H2-HBcAg-sST2 EP1-2 与 ClaI 线性化的pAdd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-sST2 EP1-2 共同转化转入 E.coli BJ5183 中进行同源重组,经过酶切鉴定,获得两个E1区表达分泌型HBcAg-sST2 EP1-2融合蛋白且同时Hexon区经sST2表位肽修饰的腺病毒载体pAd5/E1-CMV-HBcAg-sST2 EP1-2/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon-HVR5-sST2 EP1-2。将上述两个重组腺病毒载体经PacI酶切线性化后转染至HEK293细胞中进行腺病毒的包装与扩增,利用CsCl密度梯度离心法纯化获得相应的重组腺病毒。4)sST2真核蛋白的表达:将sST2全长基因克隆至慢病毒真核表达载体pUC57-kozac-IL-2 signal peptide-MCS,包装慢病毒并建立表达sST2蛋白的HEK293慢病毒细胞系。2.针对人sST2单克隆抗体的制备及应用研究1)利用杂交瘤技术分别进行抗sST2肽段及表位肽的单抗的制备,通过Western Blot及免疫沉淀等方法对获得的抗体的特异性进行了鉴定2)人sST2双抗体夹心ELISA检测方法的建立:利用所制备的单克隆抗体进行抗体的配对并建立sST2双抗体夹心ELISA,通过捕获抗体浓度、检测抗体浓度、Avidin-HRP浓度的优化,建立可用于检测sST2的双抗体夹心ELISA检测体系,并建立其标准曲线,通过组内和组间的重复检测验证建立的ELISA检测方法的稳定性是否良好。综上所述,本课题获得了如下实验结果:(1)成功制备了携带sST2肽段和B细胞线性表位肽的免疫原和筛选抗原。(2)利用杂交瘤技术成功制备了具有高效价及特异性强的抗人sST2的单克隆抗体6株,其中抗sST2 F2多肽的单抗2株,抗sST2 F3多肽的单抗3株,抗sST2 EP2表位肽的单抗1株。(3)利用制备的抗体成功建立原核蛋白sST2双抗体夹心ELISA检测方法,其检测范围是1.524 ng/ml-10μg/ml,灵敏度为4.7ng/ml,且批内及批间差异的变异系数均小于10%,具有良好的稳定性。本课题的研究结果表明基于肽段及表位肽的单抗制备策略是可行的,其为开发多种特异、灵敏的sST2含量检测方法提供了有益的借鉴,同时对其它生物标志物的双抗体夹心ELISA的建立及中和性单克隆抗体的制备提供一种新的思路和方法。