乳腺癌是女性较为常见的恶性肿瘤,目前外科手术、放疗、内分泌治疗、化疗、免疫治疗是治疗乳腺癌的主要手段。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,其在调节细胞的生长发育、代谢、分化、死亡等细胞信号转导通路中发挥着重要作用。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK 1/2)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38Mitogen-activated protein kinases,p38MAPK)为MAPKs细胞信号转导的主要通路。近来研究表明,MAPKs信号通路在乳腺癌发生进展过程中发挥着重要作用。银杏主要种植于亚洲,做为一种来源广泛的天然药物具有多年的药用历史。近年来,从银杏叶中提取了多种活性成分如苷类和萜类化合物。在这些成分,银杏素由于其在体内外具有较强的生理活性,受到了广泛的关注,银杏素具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤作用。在既往研究中,银杏素对骨肉瘤、前列腺癌和卵巢癌等多种肿瘤细胞具有抗肿瘤作用。本课题中,我们研究银杏素对乳腺癌的抗肿瘤作用及MAPKs信号通路的影响。目的:观察体内、外银杏素对人乳腺癌细胞的抗肿瘤活性,研究银杏素作用于MAPKs信号转导通路的分子机制,为银杏素的开发和抗乳腺癌临床应用提供实验依据。方法:1 MTT法检测细胞的增殖抑制MTT法测定细胞毒作用。将5.0× 103个处于生产对数期的细胞接种到96孔培养板中。将银杏素溶液单独给药或者与MAPKs信号通路抑制剂联用,加入到每个孔中,终浓度从5-300μmol/L。每个浓度设两个复孔,每个孔总量为200 μ 1。孵育24h-96h后,MTT处理细胞,然后采用DMS0溶解结晶。通过酶标仪测定并记录570nm处的吸光度。与未处理的对照组相比,计算细胞活力,使用Graphpad prism5绘制量效曲线计算IC50。2检测银杏素对人乳腺癌细胞的凋亡作用使用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法测定MCF-7细胞的凋亡。将MCF-7细胞与不同浓度的银杏素一起孵育48小时。10%的福尔马林固定细胞,将细胞脱水并包埋在石蜡中。同样,10%的福尔马林固定肿瘤组织样品,并将肿瘤组织包埋在石蜡中,在包埋在石蜡中之前固定在10%福尔马林中,制备4μm厚的组织切片并进行TUNEL分析染色。随后将载玻片用苏木精溶液复染。最后,通过激光共聚焦显微镜观察TUNEL阳性和DAPI阳性染色。随机选择10个显微镜视野中计算细胞核总数,在400×光镜下计算凋亡细胞百分比。此外,采用上述加药方法,单用银杏素或者与MAPKs信号通路抑制剂联用,使用annexin-V-FITC和PI双染,流式细胞术检测细胞凋亡。3 Capase试剂盒检测银杏素对人乳腺癌细胞中Caspase活性的影响将MCF-7细胞采用银杏素处理48小时,在冰上裂解缓冲液中裂解10分钟后收集裂解液。离心后,收集上清液。使用Capase试剂盒检测Caspase-3,Caoase-8和Capase-9活性。方法为将样品上清液与反应缓冲液中的Caspase-3,Caoase-8和Capase-9底物一起温育,随后在酶标仪中于405nm检测。4 Western Blot法检测蛋白表达使用Bio-Rad蛋白质测定法测定用于Western blot的细胞裂解液浓度。将蛋白质样品加样至10%SDS-PAGE凝胶上,随后电转移到PVDF膜上。然后使用5%BSA封闭,并用 Bcl-2,Bax,survivin,p38,p-p38,JNK,p-JNK,ERK1/2,p-ERK1/2,caspase-8,caspase-9,caspase-3 和 PARP一抗孵育,在 4℃过夜。与二抗孵育后,化学发光检测试剂盒显色。Image-Pro Plus 6定量分析条带,使用β-actin作为对照。5建立MCF-7异种移植裸鼠模型动物研究经安徽医科大学伦理委员会批准。6周龄雌性BALB/c裸鼠(20±2g)购自南京大学模式动物研究所(中国南京)。将小鼠保持在如下环境(12:12光照周期,室温恒定为21±1℃),保证食物和水供应。建立裸鼠移植瘤模型,将MCF-7细胞(1×107)皮下注射到每只小鼠的右侧乳房垫。当肿瘤平均体积超过200mm3时,将小鼠随机分成四组,每组五只。动物分组如下:对照组,银杏素(25,50,100mg/kg)组。小鼠连续8周口服给药。治疗期间,每周监测并记录体重和肿瘤体积。6免疫组化法检测MAPKs相关蛋白表达从处死的雌性BALB/c裸鼠中取出肿瘤组织,福尔马林固定,将肿瘤组织包埋在石蜡中,并连续切片(4μm厚)。将切片在二甲苯中脱蜡,切片通过逐渐降低浓度的乙醇,水化,并与p-P38,p-JNK和p-ERK抗体一起温育。使用VectastainABC试剂盒结合抗体,DAB试剂盒显示结合位点。每个部分都由病理医生随机选10个视野中观察。7统计学处理数据应用SPSS20.0软件进行统计分析,计数资料以率表示,计量资料用均数±标准差(x ±s)表示,两组间计量资料均数比较采用t检验,组间计数资料的比较采用校正x2检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1银杏素体外对人乳腺癌细胞增殖抑制作用MTT法检测银杏素对乳腺癌细胞MDA-MB-231,BT-474和MCF-7的细胞毒作用。银杏素对肿瘤细胞增殖起抑制作用,该作用呈剂量依赖性。银杏素对乳腺癌细胞的增殖抑制呈时间依赖性。肿瘤细胞对银杏素的反应有所不同。根据IC50值,肿瘤细胞对银杏素的敏感性如下:MCF-7>MDA-MB-231>BT-474。银杏素浓度为150 μmol/L时仍对正常乳腺细胞MCF-10A没有毒性作用,银杏素对正常细胞,肿瘤细胞的细胞毒作用具有高选择性。2银杏素体外诱导MCF-7细胞凋亡TUNEL法检测银杏素对MCF-7细胞的凋亡。结果表明银杏素可显著增强MCF-7细胞的凋亡。与对照相比,浓度为20-80μmol/L的银杏素诱导MCF-7细胞的凋亡率为8.9%-28.7%。此外采用annexin-V-FITC和PI双染法检测MCF-7细胞的凋亡。银杏素处理MCF-7细胞后,其凋亡率从8.5%增加至33.5%。3银杏素调节MCF-7细胞凋亡相关蛋白和诱导的半胱天冬酶活化的表达Western blot试验表明与对照相比银杏素下调Bcl-2和survivin的表达,上调Bax表达。我们进一步研究银杏素处理后是否激活caspase-3,caspase-8和caspase-9。结果显示,银杏素促使MCF-7细胞的caspase-3,caspase-8和caspase-9活性增加。银杏素处理MCF-7细胞后,细胞中caspase-3,caspase-8和caspase-9和PARP的表达水平增加。4银杏素上调MCF-7细胞中MAPKs的表达银杏素处理MCF-7细胞后,细胞中p-p38,p-JNK以及p-ERK1/2的水平增加,但银杏素对p38,JNK和ERK1/2的表达没有影响。将MCF-7细胞与银杏素及SB203580(p38特异性抑制剂),SP600125(JNK特异性抑制剂)或U0126(MEK特异性抑制剂)孵育48小时。所有抑制剂明显地拮抗了由银杏素诱导的细胞凋亡和增殖抑制。这些结果表明MCF-7细胞中MAPKs的激活可能在银杏素诱导的细胞增殖抑制中发挥作用。5银杏素体内抑制乳腺肿瘤生长。在MCF-7移植瘤模型中,银杏素对小鼠的体重无影响。银杏素可降低肿瘤体积和重量。与体外实验结果一致,与对照组相比,银杏素处理后小鼠凋亡细胞显著增加。银杏素在裸鼠MCF-7移植瘤模型中具有较好的抗肿瘤作用。6银杏素增加裸鼠肿瘤组织中的p-p38,p-JNK和p-ERK1/2阳性细胞数量在裸鼠MCF-7移植瘤模型中,我们采用免疫组化法检测MAPKs通路中p-p38,p-JNK和p-ERK1/2的表达水平。与对照组相比,银杏素处理后肿瘤组织中p-p38,p-JNK和p-ERK1/2阳性细胞数量显著增加,这与体外结果一致。结论:1银杏素对体外和体内人乳腺癌细胞有较强的增殖抑制作用。2银杏素抗肿瘤作用机制可能与银杏黄酮诱导的细胞凋亡,介导凋亡相关蛋白在Caspases和Bcl-2家族成员中的表达,调控人乳腺癌中MAPKs信号通路有关。3本研究通过研究,为银杏素抗肿瘤应用研究提供了良好的实验依据,展示了银杏素抗人乳腺癌细胞的特点和分子机制。