第一部分内含中东呼吸综合征冠状病毒和埃博拉病毒基因片段病毒样颗粒的构建及表达　　2012年9月世界卫生组织（WHO）报道,在中东地区的一位患有急性呼吸道疾病的病人中发现了一种新的SARS样冠状病毒，患者表现为急性呼吸道感染和肾功能衰竭等临床症状。后来该新型人冠状病毒病原体被命名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）。1976年在非洲国家发现了埃博拉病毒，它是引起埃博拉出血热的烈性传染病的病原，是一种目前人类已知的恐怖、致命的病毒之一。2013年埃博拉出血热重新在西非几个国家爆发，虽然我国目前没有相关疫情的爆发，但是不能排除输入性病例的可能。虽然有实验室已经建立了多种检测这两种病毒核酸的方法，但尚无质控品或安全可靠的阳性参考品。因此，需要一种RNA质控品全程监控及保证检测结果的可靠性。　　目的:　　构建内含中东呼吸综合征冠状病毒部分基因和埃博拉病毒部分GP和NP基因病毒病毒样颗粒，作为核酸检测的质控品。该质控品具有稳定好、耐 RNase、无潜在生物传染性的危害的优势，可用于全程监控RNA病毒核酸检测，对于中东呼吸综合征冠状病毒和埃博出血热病毒的实验室诊断具有重要意义及实用价值。　　方法:　　将 MS2噬菌体包膜蛋白和成熟酶蛋白基因编码序列插入到表达载体pET32a，构建成 p32MS中间载体，再 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒部分GP和 NP基因病毒基因片段连接到成熟酶蛋白基因的下游，获得的重组载体p32MS-X(MERS或Ebola)转化到E.coli BL21(DE)感受态细胞中进行诱导表达，表达产物进行纯化，然后进行耐酶实验及稳定性实验。结果获得含 MERS-CoV N基因片段的颗粒和埃博拉GP和NP基因片段颗粒，可抵抗RNase降解，在4℃保存至少120天。　　结果:　　成功构建了含 MERS-CoV N基因和埃博拉病毒 GP和 NP基因 VLPs，可抵抗RNase降解，在4℃保存120天。　　结论:　　成功构建了含MERS-CoV N基因和埃博拉病毒GP和NP基因的VLPs，其安全、稳定良好，可作为检测MERS-CoV和Ebola virus核酸的标准品和质控品。　　第二部分VLPs在多重RT-PCR检测呼吸道病毒中的应用　　呼吸道病毒是最主要引起人类呼吸系统疾病的发病率和死亡率的原因之一，特别是婴幼儿和老人。近年来市场上有多种多重检测呼吸道病毒的商业试剂盒，但费用很高，且使用过程中需要专用设备，很难推广使用。　　目的:　　我们已经建立了基于QIAxcel自动化毛细管电泳仪的两管同时检测16种呼吸道病毒的方法（9+7方法），本研究拟通过进一步的改进使之成为一种灵敏度高、特异性更好、内参稳定，更高效迅速的方法，进一步提高全国疾控系统常规监测呼吸道病毒的能力。　　方法:　　改进已经建立两管同时检测16种呼吸道病毒的方法为一管检测13种呼吸道病毒及亚型（13重法），能检测到的呼吸道病毒包括：甲型流感病毒(FluA)，乙型流感病毒(FluB)，09年季节性流感病毒 H1N1亚型(09H1N1)，季节性流感病毒H3N2亚型 H3N2(sH3N2)，副流感病毒1-4型(PIV1-4)，鼻病毒(HRV)，腺病毒(Adv)，呼吸道合胞病毒 A型(RSVA)，呼吸道合胞病毒 B型(RSVB)和人偏肺病毒(HMPV)。在提取样本核酸前中加入噬菌体MS2 VLPs作为内参，针对13种病毒及亚型设计14对嵌合引物、一个通用引物(Tag)、一对内参引物(MS2 F, MS2 R)，所有引物均加入一个反应体系，并优化扩增条件。用两管检测16种呼吸道病毒的方法作为参考标准，并使用310份临床标本对这两种方法进行评价和比较，对两种方法检测结果不一致再重复试验和测序验证。　　结果:　　建立了一种基于 Qiaxcel系统的单管多重 RT-PCR检测13种呼吸道病毒及亚型的方法。通过检测310份临床标本，与已建立的两管同时检测16种呼吸道病毒的方法比较，阳性率分别为72.90％和69.03%。两种方法检测病毒的一致高达97.10%，单管多重 RT-PCR检测腺病毒、鼻病毒、人偏肺病毒和副流感病毒1型和3型的灵敏度明显高于两管法，表明单管多重 RT-PCR检测呼吸道病毒的体系灵敏度和特异更好。　　结论:　　1.噬菌体 MS2 VLPs作为稳定内参保证了单管多重 RT-PCR检测呼吸道病毒结果的有效性。　　2.单管多重 RT-PCR检测呼吸道病毒的方法有更稳定的内部质控，特异性和灵敏度更好，更快速和方便检测的优势具有在全国疾控系统应用于呼吸道病毒感染中的常规监测的潜力。