B3型柯萨奇病毒(CVB3)是一种典型的肠道病毒,感染人体导致机体一系列急性或慢性疾病,如心肌炎、脑膜炎、胰腺炎等。病毒性心肌炎的慢性化过程伴随着心肌纤维化,常与炎症并存于病变心肌部位。研究已证实在CVB3诱导的心肌炎小鼠模型中炎症细胞与心室的纤维化相关,其通过分泌细胞因子、趋化因子或生长因子等形成炎症微环境使成纤维细胞异常分泌ECM。心肌纤维化可导致心肌壁增厚、心脏扩张、心肌功能逐步丧失,已成为影响人类健康的重大卫生问题,但是迄今还没有有效防治心肌纤维化的措施。心肌纤维化是指心脏组织中异常活化的心肌成纤维细胞,过量分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM),导致基质蛋白在心肌层大量积累的一种在多种心血管疾病中普遍存在的病理变化,与心律失常、心功能障碍甚至心肌性猝死密切相关。已有研究发现T淋巴细胞能够调节纤维化的发生,并提出炎症细胞与心室纤维化相关。近期研究发现不同T细胞亚群在小鼠心室重构中发挥不同作用。炎症条件下,Thl应答具抗纤维化作用,然而Th2却会促进纤维化。调节性T细胞(Treg)是一群具有免疫抑制作用的CD4+T细胞亚群,其在维持免疫耐受以及调节抗病毒免疫应答中扮演了重要的角色。但是Treg在CVB3诱导的心肌纤维化中作用及作用机制仍不是很清楚。为了阐明Treg在小鼠病毒性心肌炎纤维化过程中的作用及其可能免疫机制,在本研究中,我们利用CVB3感染雄性BALB/c小鼠诱导心肌纤维化模型,观察了CVB3感染过程中心肌炎纤维化发生的过程,并检测了其中Treg的动态改变。随后,通过体内清除和体内输注Treg,进一步阐明了Treg对于病毒性心肌炎纤维化发生的作用；最后,通过体内外试验,初步阐述了Treg参与病毒性心肌炎纤维化的作用的分子免疫学机制。第一部分CVB3感染诱导心肌纤维化小鼠模型的建立以10TCID50CVB3感染BALB/c雄性小鼠,用real time-PCR检测了与胶原蛋白合成相关的Ⅰ型胶原蛋白(collagen I),与胶原蛋白降解相关的基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1) mRNA的表达变化；以天狼猩红染色检测心肌层胶原纤维的沉积情况。实验结果表明,随CVB3感染时间的延长,小鼠心脏局部collagen I mRNA水平显著增高；MMP-1和MMP-3mRNA的表达量显著下调,相对于对照组,TIMP-1mRNA的表达量在1到4周均上调,TIMP-1/MMP-1和TIMP-1/MMP-3的比值均明显增高。同时病理显示：感染小鼠的心肌层积累了大量的胶原纤维。以上数据表明,我们用10TCID50CVB3感染雄性BALB/c小鼠,成功建立了病毒性心肌纤维化模型。第二部分Treg在CVB3诱导心肌纤维化发生中的作用一、Treg与CVB3诱导的心肌纤维化呈负相关为了研究Treg是否在心肌纤维化过程中发挥作用,我们首先以流式细胞术检测了CVB3感染后小鼠体内Treg的变化。结果表明,CVB3感染后第1周外周血和心脏组织中分别含有0.22%和1%Treg,之后其比例逐步下降。提示在心肌纤维化越来越严重的阶段(2-4周),Treg的比例逐步减少。为明确Treg与心肌纤维化的相关性,在CVB3感染小鼠4周时,检测了每一只小鼠外周血中Treg的比例以及胶原蛋白mRNA的表达水平和小鼠心脏中胶原纤维的沉积程度。结果表明,小鼠外周血Treg越少,其胶原蛋白mRNA表达量越多,而且心脏中胶原沉积的程度越严重。以上数据证明Treg与心肌纤维化呈负相关,并初步提示调节性T细胞具有抑制纤维化的作用。二、去除Treg可加剧CVB3诱导的心肌纤维化为了进一步证明Treg具有抑制纤维化作用,以anti-CD25单克隆抗体腹腔注射小鼠去除CVB3感染小鼠中的Treg,观察心肌纤维化的情况。发现,相对于对照组(Isotype+CVB3组),anti-CD25注射组小鼠心脏局部collagen I表达显著上调,TIMP-1、TIMP-1/MMP-1以及TIMP-1/MMP-3表达上调,提示胶原蛋白合成增加而降解减少。天狼猩红染色与上述结果一致,在体内去除Treg的小鼠心肌层中,沉积了更多的胶原纤维。以上实验提示,在CVB3诱导的心肌纤维化模型中,去除Treg可加剧心肌纤维化程度。三、输注Treg可缓解CVB3诱导的心肌纤维化以上结果提示小鼠Treg不足时,CVB3感染后会导致更为严重的心肌纤维化。我们推测增加小鼠体内的Treg的数量,可缓解CVB3诱导的心肌纤维化。为验证这一推论,从感染的小鼠脾脏中分离得到Treg并将其回输至小鼠体内,并用CVB3感染小鼠。发现：较只感染了CVB3的小鼠,输注Treg的小鼠心肌层中胶原沉积大幅减少,心脏局部collagen I、TIMP-1、TIMP-1/MMP-1和TMP-1/MMP-3的变化同样有利于心肌纤维化得到改善。实验结果提示,体内增加Treg数量有利于缓解CVB3诱导的心肌纤维化。综合以上实验结果提示,Treg能够显著抑制CVB3诱导的心肌纤维化,干预小鼠体内的Treg数量,可显著改变心肌纤维化的发生发展。第三部分Treg抑制CVB3诱导心肌纤维化的分子机制一、Treg抑制心肌纤维化作用的细胞非接触途径可能通过TGFβ和IL-10介导已知Treg通过细胞接触和细胞非接触机制(分泌抑制性细胞因子)发挥抑制功能,为研究Treg抑制CVB3诱导的心肌纤维化的作用机制,我们在回输Treg的同时分别给予小鼠抗TGFβ或抗IL-10的中和抗体。发现,相较于输注Treg小鼠,TGFβ抗体组和IL-10抗体组的小鼠心肌层均发现更多的胶原纤维沉积。以上结果初步提示,TGFβ和IL-10在Treg介导的减弱心肌纤维化的过程中均发挥重要作用。为了进一步证实TGFβ和IL-10在抑制CVB3诱导的心肌纤维化中的作用,我们用anti-CD25去除小鼠体内Treg,同时分别注射细胞因子TGFβ或IL-10。结果显示,去除了Treg的小鼠心肌纤维化显著加重,而在此基础上补充细胞因子TGFβ和IL-10可一定程度上减轻心肌纤维化,但仍然要比未去除Treg组的感染小鼠的心肌纤维化严重。以上数据表明,Treg改善CVB3诱导的心肌纤维化部分依赖于细胞因子TGFβ和IL-10,同时也提示,Treg可能还通过其他途径如细胞接触机制抑制心肌纤维化的发生。二、Treg抑制心肌纤维化作用存在细胞接触和非接触途径体内试验已经发现Treg可通过分泌细胞因子发挥抑制心肌纤维化的作用,我们通过体外试验进一步验证Treg抑制成纤维细胞的作用机制。从感染了CVB3的小鼠心脏中分离得到心肌成纤维细胞(cardiac fibroblast, CF)和Treg,二者以不同比例(CF:Treg;1:1,1:2.5,1:5)共培养,检测其工型胶原蛋白(collagen工)、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1) mRNA的表达水平,发现Treg能够减少成纤维细胞工型胶原蛋白collagen I的合成,同时降低TIMP-1的表达,并且呈剂量依赖。为阐明体外Treg抑制心肌成纤维细胞的分子机制,采用transwell培养体系共培养成纤维细胞和Treg,发现：相较于接触培养体系中成纤维细胞collagen I的表达量,非接触培养体系中成纤维细胞的collagen I的表达量增多,说明Treg能够通过分细胞接触抑制的途径抑制成纤维细胞；相对于对照组(不加Treg),非接触Treg共培养的成纤维细胞的collagen I下调表达,说明Treg能够通过分泌细胞因子抑制成纤维细胞。提示:Treg与成纤维细胞之间的相互作用部分依赖细胞接触,部分依赖分泌细胞因子。接下来,向非接触的共培养体系中分别添加不同浓度的抗TGFβ和抗IL-10的抗体,发现IL-10抗体能够有效地降低Treg对心肌成纤维细胞的抑制功能。体外实验提示,Treg主要通过细胞接触和分泌细胞因子(IL-10)的途径发挥对心肌成纤维细胞的抑制作用。综上所述,我们阐明了调节性T细胞可通过细胞接触依赖和细胞非接触依赖的途径抑制CVB3诱导的心肌纤维化。在CVB3诱导的病毒性心肌纤维化过程中,Treg比例与心肌纤维化程度呈负相关。体内清除Treg可加剧心肌纤维化,而输注Treg则可缓解心肌纤维化程度,提示Treg具有显著抑制心肌纤维化的作用。进一步体内外中和试验提示：Treg抑制心肌纤维化的作用部分依赖于Treg分泌的细胞因子,部分依赖于Treg膜表面的抑制性分子,具体机制还需深入研究。本研究以Treg为切入点,深入研究其在CVB3病毒性心肌炎纤维化中的作用及其分子机制,尚未见报道,具有创新性,可有助于心肌纤维化机制的进一步阐明,同时提供了基于干预Treg功能分子的心肌纤维化防治新靶点。