在哺乳动物中,性别决定和分化是由雄性和雌性特异基因之间的对抗和平衡来实现的。同时,滤泡和卵母细胞之间的协调作用对于卵巢分化也是不可或缺的。原始卵泡是生殖系统中最基本的单位,调控卵泡和胚胎形成的转录因子在卵泡生长和发育过程早期已经表达并发挥功能,其中Figla是最早表达的生殖细胞特异的性转录因子之一,它对卵泡的早期发育有重要的调控作用。研究报道,小鼠的Figla基因最早可以在13.5d的雌性胚胎的生殖嵴中表达,且持续表达于发育过程中的卵泡和生殖细胞簇中,Figla可激活雌性生殖细胞特异基因的表达,调节卵泡的发育、Zp基因的表达以及透明带的形成过程。同时,哺乳动物Figla能够抑制雄性生殖细胞特异基因的表达。众所周知,尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)是重要的世界性养殖鱼类,其单性鱼苗易于获得,因此罗非鱼是研究鱼类性别决定与分化不可或缺的良好实验模型。本研究中,我们通过基因组以及性腺转录组等生物信息学手段对罗非鱼Figla基因进行了分离和鉴定,且做了大量的分析工作；实验采用real-time PCR和免疫组化等方法来分析罗非鱼Figla/Figla的表达模式；创新性地使用TALENs介导的基因敲除和转基因过表达两种方法,从正反两个方面来开展对Figla基因功能方面的研究工作,以此来阐明Figla在罗非鱼卵巢分化中的可能作用和分子机制。我们的主要研究结果如下：1)本研究成功地从尼罗罗非鱼卵巢cDNA中获取Figla开放读码框(ORF, Open Reading Frame),其编码198个氨基酸。氨基酸同源性比对发现,罗非鱼Figla基因编码了保守结构域：bHLH,且在鱼类进化过程中较为保守；系统进化分析结果表明,罗非鱼Figla与其他硬骨鱼类的Figla聚为一簇,而其他四足动物的Figla单独聚为一簇；通过共线性分析我们发现,鱼类Figla基因在其上下游都具有较为保守的基因座位,如：HK2, ADD2, SNRNP27, MXD1等基因。而在四足类和哺乳类对应染色体的相同部位我们也发现了同样的基因座位。2)我们分别运用real-time PCR和免疫组织化学等方法检测了Figla组织分布和个体发生过程的时空表达模式。组织分布研究发现,罗非鱼Figla在卵巢中的表达水平要明显高于其它组织。在个体发生过程中,Figla的表达水平在孵化后30dab(days after hatching)出现显著的上升,3 mah (months after hatching)时达到最高(生殖细胞减数分裂启动的关键时期),4mah时开始下降。我们利用免疫组化来检测Figla在罗非鱼性腺中的蛋白水平的表达情况,其检测结果与real-time PCR结果一致,Figla蛋白表达于3月龄和5月龄罗非鱼卵巢的初级卵母细胞中,然而在精巢中却检测不到Figla阳性信号。这些表达模式表明,Figla可能在罗非鱼卵巢的分化和维持中起重要作用。3)利用TALENs靶向基因敲除技术对Figla基因敲除结果发现,TALENs能高效(约52.5%)地对Figla基因进行编辑,利用PCR和测序检测到包括删除不同碱基数目(4、8、20等)的突变类型。此外,3月龄XX的Figla敲除个体出现卵巢发育异常,表现为卵母细胞大量或完全缺失,并伴随体细胞的大量增生。免疫组化结果显示,在Figla基因敲除阳性个体的卵巢中检测到雄激素(11-KT)合成酶(Cypllb2)的表达,但几乎不能检测到雌激素(E2)合成酶(Cypl9ala)的表达。通过检测血清激素水平发现,血清11-KT水平升高,E2水平随之降低。结果表明像哺乳动物一样,在雌性个体中Figla基因突变导致大量卵母细胞退化,同时,原始滤泡向雄性间质细胞转分化。4)同时,我们构建了转基因过表达载体pIRES-hrGFP-1 a-Figla,在罗非鱼遗传全雄(XY)个体中过表达Figla,分析其在雄性性腺发育过程中的可能作用。我们对Figla过表达阳性个体性腺进行了常规的组织学观察,发现其精子发生过程受到了严重阻碍,具体表现为精巢中减数分裂的精母细胞和精子细胞受损。Sycp3 (synaptonemal complex protein 3)和prm (protamine)表达量急剧下降,也印证了这一事实。尽管Figla过表达雄鱼的支持细胞(dmrt1)和间质细胞(star和cyp17a1)的标志基因的表达没有受到影响,但hsd3b1的表达量却出现明显上升。总的来说,在雄鱼中过表达Figla可抑制精子发生相关基因的表达。综上所述,本研究从罗非鱼中分离出Figla,序列比对和系统进化分析表明它在脊椎动物进化过程中较为保守。在XX个体中敲除Figla导致卵巢退化,Cypllb2表达量明显增高,前滤泡细胞转分化为Leydig细胞,与对照组相比,血清11-)KT水平显著升高,E2水平随之降低。因此我们推测,Figla在鱼类卵巢分化和维持中可能发挥重要作用。在雄性罗非鱼中过表达Figla导致精子发生过程严重被破坏。与正常三月龄XY个体相比,过表达Figla的阳性鱼GSI显著降低,表明其性腺分化和发育过程受损,性腺形态严重缺陷进一步说明过表达Figla抑制了精母细胞分化和精子的成熟。同时,Sycp3和prm表达量下降也印证了这一事实。说明Figla在精巢的异常表达可能导致精子发生过程紊乱。因此,我们推测罗非鱼Figla主要功能是抑制精子发生相关基因的表达,进而抑制精巢发育,最终实现其支持雌性卵巢分化的功能。