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近年来,随着人们生活水平的不断提高,对肉制品、奶制品等的需求增加,促进了我国养殖业迅速发展。牛粪是奶牛养殖过程中不可避免的污染物,大量的牛粪若不经处理直接排放,不仅会对周边环境造成污染,还会对人类的健康产生威胁。如何快速有效地处理牛粪成为一项亟待解决的关键问题。牛粪中含有可被微生物利用的有机成分及纤维素,具有转化成奶牛卧床垫料的潜能。近几年新兴起的滚筒式好氧发酵处理技术-BRU(Bedding Recovery Unit)卧床垫料再生系统,具有处理耗时少,占地面积小,并能在处理过程中去除病原菌的优点,但是目前国内外仍缺少对BRU系统实际运行过程中物料性质及其中重金属及粪大肠菌群等污染物的系统性研究,致使该技术无法大范围推广。为了考察奶牛场粪污制备卧床垫料过程中的牛粪性质及相关污染物含量的周年变化规律,本研究选择天津市一家规模化奶牛养殖场作为研究对象,进行不同阶段、不同季节的连续采样,并对样品中的TN、TP、pH、含水率、有机质、粪大肠菌群和Cu、Zn等重金属进行了系统检测分析。检测数据分析显示:泌乳牛牛粪中的TN、TP、VS、Cu、Zn的排放量存在显著性季节差异(P<0.05),且TN、TP、Cu、Zn、Cd的排放量均以冬季最高;经过BRU好氧发酵处理后,再生固体牛粪中的含水率、重金属Zn和粪大肠菌群的含量出现不同程度的降低,而TN、TP和重金属Cu的含量则基本呈现升高趋势。本研究将PMA(叠氮溴化丙啶)与qPCR相结合,建立了PMA-qPCR定量检测方法,以实现对再生固体牛粪(Recycled Manure Solid,RMS)中病原菌活菌的定量检测。PMA的选择性功能与菌株种类有关,故选取了一株革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和一株革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)进行试验,分析PMA的作用条件。对PMA作用的光反应时间、最低效应浓度、不影响活菌扩增的浓度等因素进行了试验。通过试验分析发现OD600值为0.5左右的大肠杆菌,在光反应时间为1min,PMA浓度为60μg/mL时,即可抑制样本中膜损伤菌DNA的扩增。当PMA浓度升至100μg/mL时未对活菌产生影响。OD600值为0.5左右的金黄色葡萄球菌在光反应时间为1min,PMA浓度为65μg/mL即可抑制样本中膜损伤菌DNA的扩增。当PMA浓度升至100μg/mL未对金黄色葡萄球菌活菌产生影响。本研究设计构建了针对大肠杆菌uidA基因和金黄色葡萄球菌nuc基因特定序列的质粒标准品,建立的标准曲线R2分别为0.993和0.998,为PMA-qPCR方法的稳定性提供了保证。将PMA-qPCR方法应用于牛粪卧床垫料样本,发现使用单层无菌纱布对再生固体牛粪悬浊液进行过滤预处理可以去除大部分颗粒物,且未对样品中的菌含量产生显著性影响(P>0.05)。使用PMA-qPCR对BRU系统处理前后样品进行检测发现其对样品中活菌有去除效果且效果较好。使用PMA-qPCR方法检测牛粪卧床垫料样品是对奶牛场垫料活性致病菌定量检测的一次成功尝试。PMA-qPCR技术能够有效、快速地区分活菌和死菌,实现对病原菌活菌的定量。该技术还可推广至其他环境性致病菌,在其它环境样品中致病菌活菌定量检测领域将有更广阔的发展前景。