严重创伤时机体免疫系统出现异常。急性创伤造成的组织损伤、疼痛、失血、以及应激反应均不同程度地导致了免疫紊乱。研究发现,大手术后的机体免疫功能异常主要为以炎症反应增强为代表的免疫反应过度和淋巴细胞功能受抑为代表的免疫应答低下。一方面淋巴细胞增殖功能受抑和白细胞介素-2等产生降低,造成手术后机体抗感染能力下降,疾病易感性增加;另一方面表现出以全身性炎症反应综合征为特征的过度炎症反应,而炎症进一步失控将造成多器官功能障碍,诱发多器官功能不全综合症。如何纠正创伤应激导致的免疫紊乱、提高机体的抗感染能力、尽早恢复健康,是人们普遍关心的一个问题。　　 针灸是我国传统医学的瑰宝,具有经济、简便、安全、有效的优点,长期的临床实践检验已确认其对某些疾病的确有效。近年来,针刺以其特有的双向良性调节作用日益受到人们的重视,我们通过临床及动物实验均证实电针能有效地改善创伤应激导致的免疫抑制,主要是通过下丘脑—垂体—肾上腺轴、交感神经系统以及内源性阿片肽系统改善细胞免疫抑制。然而,以往的研究多集中于针刺调节创伤应激引起的免抑抑制,对于针刺调节创伤应激引起的炎症反应过度方面,尚缺乏研究。　　 最近的研究表明天然免疫系统的激活可能在创伤后免疫紊乱中起了始动作用。Toll样受体(Toll like receptor,TLR),作为重要的天然免疫调节分子,广泛表达于各种免疫细胞及非免疫细胞表面,在病原体识别、炎症和免疫应答中都起着十分重要的作用。已有研究表明TLRs的高表达与许多炎症性疾病有关,可见TLR水平可影响多种炎症反应,TLRs表达的强弱以及是否激活将直接影响机体的炎症反应强弱并成为联系天然免疫与获得性免疫的纽带。　　 以往有研究表明,机体损伤后外周组织炎性细胞因子表达增加,电针能调节机体的炎症反应。那么,创伤应激时发生的免疫紊乱是否和TLR2/4激活有关,电针的抗炎作用是否和调节TLR2/4表达有关,电针调节TLR2/4的途径如何?这是本研究拟探讨的第一个问题。　　 除了免疫系统自身的功能变化及调节外,神经系统也参与了对创伤时免疫功能的调控。近年来的研究发现,神经元并非是神经系统中参与对免疫系统调控的唯一要素,神经胶质细胞,尤其是小胶质细胞在多种疾病的发病过程中也扮演着重要角色。疾病状态下,如外周神经损伤、单发性关节炎、脑缺血、慢性病理性疼痛、神经退行性病变(如帕金森氏病,老年痴呆病)等时,均观察到小胶质细胞的快速活化,释放多种炎性细胞因子,而抑制小胶质细胞的活动则可显著改善疾病的病程,产生诸如镇痛、抗炎、促进神经修复等效应,提示小胶质细胞的激活能导致痛敏,并且其持续激活与疾病的发生、发展密切相关。我们以往的研究也发现创伤应激后8h中枢小胶质细胞被激活,产生IL-1β增多,但是小胶质细胞激活是否和TLR2、4功能活动增强有关,小胶质细胞激活在创伤后免疫功能紊乱中的作用,以及小胶质细胞激活在电针调节创伤大鼠免疫功能中的作用仍不明。以往研究小胶质细胞活化主要采用形态学方法分析小胶质细胞的激活,在本研究课题中,我们拟采用Percoll法分离全脑小胶质细胞,着重观察创伤应激模型大鼠小胶质细胞的功能变化,包括小胶质细胞数量、细胞表面TLR2/4表达以及炎性细胞因子的合成等变化,电针是否能通过抑制小胶质细胞的激活产生免疫调节效应?干扰中枢小胶质细胞功能能否增强电针调节手术后免疫功能的效应?这是本研究拟探讨的第二个问题。　　 有研究显示小胶质细胞的激活和其表面表达的功能性β-肾上腺素能受体(β-AR)有关;临床研究结果显示β-AR阻断剂治疗能明显改善创伤病人尤其是脑损伤病人的预后;那么β-AR是否介导了创伤应激时小胶质细胞的激活?激活β-AR对离体培养的小胶质细胞的功能有何影响?这是本研究拟回答的第三个问题。　　 综上所述,本课题拟在创伤应激(surgical trauma stress)引起的免疫功能紊乱大鼠模型上,从分子生物学到形态学等不同方面,从整体到离体等不同水平,采用Real-Time RCR、Western Blot、ELISA、免疫荧光化学、全脑小胶质细胞分离技术以及离体小胶质细胞培养等技术,观察创伤应激和电针对天然免疫调节分子TLR2、4和炎性细胞因子的影响,从外周和中枢两个不同角度探讨针刺免疫调节的作用机理,结果如下:　　 一、创伤应激及电针对外周TLR2/4和炎性细胞因子表达的影响　　 1.1创伤应激后脾脏TLR2/4表达及炎性细胞因子表达的时程变化　　 16只大鼠随机分为4组,每组4只动物,正常对照组大鼠4只,创伤应激组共12只,分别于手术后2小时,24小时和48小时后处死动物,取脾脏组织抽提总RNA,采用RT-PCR方法检测组织中TLR2、TLR4和炎性细胞因子mRNA的时程变化。结果发现IL-1β,IL-6和TNF-α mRNA创伤后2小时即升高,IL-1β和TNF-α创伤后24小时表达到达高峰,48小时mRNA表达恢复至正常水平。TLR2 mRNA的表达和IL-1β的表达呈现相同的变化趋势,在创伤后24小时达到高峰。TLR4 mRNA的表达在几个时间点未检测到有显著性变化。根据该实验结果,选择创伤后24小时作为后面实验的观察点。　　 1.2电针抑制创伤应激大鼠脾脏TLR2/4表达　　 采用Real-Time PCR和Western Blot方法检测创伤应激及电针后24小时脾脏TLR2/4的表达情况。Real-Time PCR结果显示,创伤应激后24小时,脾脏TLR2 mRNA显著升高(P＜0.001),电针能显著抑制创伤应激引起的TLR2 mRNA表达(P＜0.05),而TLR4mRNA表达与对照组相比无明显统计学差异。Western Blot结果显示,创伤应激24小时后,脾脏TLR2/4蛋白表达显著增高,电针能完全阻断创伤应激导致的TLR2蛋白表达,部分阻断TLR4蛋白的表达。　　 1.3电针抑制脾脏和循环血中炎性细胞因子表达　　 TLR受体激活后会导致下游信号分子NF-κB的激活,并进一步诱导炎性细胞因子合成。为检测创伤应激后外周炎性细胞因子的表达情况,采用Real-time PCR方法检测创伤应激和电针对脾脏IL-1β,IL-6,TNF-αmRNA的表达,运用ELISA方法检测脾脏和血液循环中三种细胞因子的蛋白分泌水平。结果显示,创伤应激24小时脾脏IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA都显示不同程度的增加,分别为IL-1β增加4.36倍,IL-6增加3.57倍,TNF-α增加5.18倍,电针能不同程度地降低升高的炎性细胞因子水平。ELISA结果显示,创伤后24小时脾脏IL-1β和TNF-α蛋白表达水平较正常对照组相比显著增加(P＜0.05,P＜0.05),电针能拮抗创伤应激引起的IL-1β和TNF-α的升高,创伤应激24小时IL-6的水平未发生明显变化。创伤应激后外周血循环中炎性细胞因子的分泌结果显示,创伤应激24小时循环血中IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白水平均有不同程度的升高,电针能拮抗IL-1β和TNF-α的升高,但是对IL-6的表达无显著影响。　　 1.4HPA轴及交感神经系统在电针调节创伤应激大鼠外周TLR2/4及炎性细胞因子表达中的作用　　 1.4.1运用双侧肾上腺切除术,观察HPA轴在该过程中的作用　　 为探讨HPA轴在创伤应激后TLR2、4表达增高及炎性反应中的作用。我们采用双侧肾上腺切除术,观察肾上腺缺失对创伤大鼠免疫反应的影响。大鼠在创伤应激前3周施行双侧肾上腺切除术,假肾上腺切除(sham)组施行同样的背部手术,但是保留肾上腺,同样喂养3周后进行造模。结果显示,ADX切除3周后对正常大鼠脾脏TLR mRNA和炎性细胞因子表达无明显影响。缺失肾上腺的大鼠创伤应激后脾脏IL-1β mRNA和蛋白表达以及外周血中IL-1β蛋白表达较创伤应激组大鼠明显升高(P＜0.05),说明肾上腺参与对创伤应激时脾脏细胞因子分泌的调节。但是肾上腺切除对IL-6和TNF-α的表达未见有明显影响。在缺乏肾上腺的创伤应激大鼠上施行电针,发现电针可降低肾上腺切除的创伤大鼠脾脏和外周血中IL-1βmRNA和蛋白表达(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05,),降低脾脏IL-6mRNA(P＜0.05),降低脾脏和外周血中TNF-α蛋白表达(P＜0.05,P＜0.05),降低TLR2mRNA表达(P＜0.05),说明电针调节创伤后TLR和炎性细胞因子分泌是不依赖于肾上腺的。　　 1.4.2运用化学性交感切断术及beta-肾上腺素受体阻断剂观察交感神经在该过程中的作用　　 1.4.2.16-OHDA或propranolol对创伤应激大鼠TLR2/4表达的影响　　 创伤应激后24h,大鼠麻醉处死后取脾脏,Real-Time PCR检测TLR2/4mRNA表达,Western Blotting分析TLR2/4蛋白水平。结果显示,创伤应激后,脾脏TLR2mRNA表达显著升高(P＜0.001),预先给予6-OHDA或propranolol可阻断创伤应激诱导的TLR2mRNA的升高。TLR4mRNA在创伤应激后24h未观察到有明显变化。Western Blotting方法检测TLR2/4蛋白表达,结果显示,创伤应激后24hTLR2和TLR4蛋白表达显著增加(P＜0.05,P＜0.01)。6-OHDA或propranolol均可拮抗创伤应激导致的TLR2、4蛋白表达升高。　　 1.4.2.26-OHDA或propranolol对创伤应激大鼠脾脏炎性细胞因子表达的影响　　 创伤应激24h脾脏IL-1β,IL-6,TNF-α都显示不同程度的增加,6-OHDA或propranolol能部分拮抗由于创伤应激导致的IL-1β和TNF-αmRNA增加,但是对IL-6的表达无显著影响。　　 1.4.3电针对创伤应激大鼠外周血中去甲肾上腺素含量的影响　　 大鼠创伤应激2h后外周血中的去甲肾上腺素含量明显升高(P＜0.001),电针能部分降低由创伤应激导致的大鼠外周血中去甲肾上腺素含量升高(P＜0.001与创伤应激组相比)。说明电针能抑制交感神经末梢释放去甲肾上腺素。　　 小结:　　 上述实验结果提示,创伤应激可导致大鼠外周TLR2、TLR4表达增加,炎性细胞因子合成和分泌增加,电针能抑制创伤后大鼠炎症反应,这种抑制作用和电针抑制创伤应激后的交感神经活动有关,肾上腺不参与电针调节炎症反应。　　 二、创伤应激及电针时对中枢TLR2/4及炎性细胞因子表达的影响　　 2.1创伤应激及电针对中枢TLR2、TLR4表达的影响　　 大鼠创伤应激后24h,麻醉灌流处死后取下丘脑组织,Real-Time PCR方法检测下丘脑组织TLR2、TLR4 mRNA表达,Western Blot方法检测蛋白表达水平。结果显示,下丘脑组织TLR2、TLR4 mRNA在创伤后均有不同程度的升高,分别升高1.87倍(P＜0.05)和2.22倍(P＜0.01)。电针能完全阻断由创伤引起的TLR2 mRNA升高,部分降低TLR4 mRNA升高。TLR2、TLR4的蛋白表达和mRNA表达呈现较为一致的变化,创伤24h后下丘脑TLR2、TLR4蛋白表达显著升高(P＜0.01)。电针能抑制创伤应激引起的TLR2、TLR4蛋白表达。　　 2.2创伤应激及电针对中枢炎性细胞因子表达的影响　　 创伤应激后24h,麻醉灌流后取下丘脑,Real-time PCR方法检测下丘脑组织IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA表达,ELISA方法炎性细胞因子蛋白表达水平。结果显示,下丘脑组织IL-1β,IL-6,TNF-α mRNA在创伤后均有不同程度的升高,分别升高2.33倍(P＜0.01)、2.47倍(P＜0.01)和3.22倍(P＜0.001)。电针能抑制由创伤引起的IL-1β和TNF-α mRNA升高,对IL-6 mRNA表达有降低趋势,但是统计学上无显著性差异(P＞0.05)。下丘脑组织IL-1β,IL-6,TNF-α的蛋白表达和mRNA表达呈现较为一致的变化,创伤24h后下丘脑IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表达显著升高(P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01),电针能抑制创伤应激引起的IL-1β和TNF-α蛋白表达。　　 2.36-OHDA或propranolol对创伤应激大鼠中枢TLR2/4和炎性细胞因子表达的影响　　 大鼠创伤应激后24h,麻醉灌流处死后取下丘脑组织,propranolol为造模前30min腹腔注射。结果显示,外周化学性交感神经切断术对创伤应激引起的下丘脑TLR2、TLR4 mRNA表达升高无显著影响,而ip.propranolol可以抑制创伤应激引起的TLR2、TLR4 mRNA表达升高(P＜0.05,P＜0.01)。同时检测下丘脑炎性细胞因子在给予外周交感神经切断术和β-受体阻断剂后的变化,结果显示,6-OHDA对于创伤应激引起的IL-β,IL-6,TNF-αmRNA升高无显著性影响,而β-受体阻断剂propranolol能部分阻断创伤应激引起的IL-6,TNF-αmRNA升高(P＜0.01,P＜0.01)。　　 小结:　　 上述实验结果提示,创伤应激可导致大鼠中枢下丘脑TLR2、TLR4表达增加,炎性细胞因子合成和分泌增加,该作用是由中枢而非外周β-肾上腺素受体介导的。电针能抑制创伤应激引起的中枢下丘脑TLR2、TLR4和炎性细胞因子合成,提示电针能调节中枢的神经免疫反应。　　 三、中枢小胶质细胞在电针调节创伤应激大鼠TLR2/4及炎性细胞因子表达中的作用　　 3.1创伤应激及电针后中枢小胶质细胞的变化　　 大鼠创伤应激后24h灌流固定取脑,免疫荧光染色分析小胶质细胞形态学变化,分离中枢神经系统单个核细胞,计数,同时运用流式细胞仪检测细胞表面TLR2、4表达变化,ELSA方法检测炎性细胞因子表达水平。　　 3.1.1创伤应激及电针后中枢小胶质细胞形态学变化　　 免疫荧光组织化学结果显示,创伤应激24h后下丘脑区小胶质细胞大量激活,3天后仍有少量增加,7天基本恢复至正常水平。激活的小胶质细胞胞体变大,突起变短、变厚、变少,呈阿米巴样改变。电针能明显抑制创伤应激诱导的小胶质细胞激活。　　 3.1.2创伤应激及电针后中枢小胶质细胞数目的变化　　 创伤应激后24h,大鼠麻醉后灌流,取全脑,分离脑单个核细胞,正常大鼠分离中枢单个核细胞,经流式细胞仪鉴定,98％为CD-11b阳性细胞,故可认为分离所得的单个核细胞基本为小胶质细胞,计数分离的小胶质细胞。结果显示正常大鼠脑小胶质细胞总数约为154.8±6.9(X104),创伤应激24h中枢小胶质细胞总数明显增加(P＜0.01),总数为191.7±10.8(×104)。电针能明显抑制创伤应激大鼠中枢小胶质细胞数目,为163.9±8.3(×104)(P＜0.05)。　　 3.1.3创伤应激及电针后中枢小胶质细胞TLR2、TLR4表达的变化　　 创伤后24h后,麻醉灌流取脑,分离中枢单个核细胞,运用特异性抗体染色后在流式细胞仪上检测细胞表面TLR2/4的表达。结果显示,创伤应激24h后大鼠小胶质细胞表面TLR2和TLR4表达明显升高(P＜0.01,P＜0.01),电针能显著降低创伤后小胶质细胞表面表达TLR2和TLR4。　　 3.1.4创伤应激及电针后中枢小胶质细胞炎性细胞因子表达的变化　　 创伤后24h后,麻醉灌流取脑,分离中枢单个核细胞,运用ELISA方法分析创伤应激后小胶质细胞炎性细胞因子表达情况。结果显示,创伤应激24h后大鼠小胶质细胞IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表达在创伤后均有不同程度的升高,IL-1β从21.2±3.12升高到60.7±2.42pg/100ugprotein(P＜0.01vsControl组),IL-6从40.5±7.29升高到120.6±16.23pg/100ugprotein(P＜0.01vsControl组),TNF-α从11.2±2.09升高到38.7±3.98pg/100ugprotein(P＜0.05vsControl组)。电针能抑制由创伤引起的IL-1β和TNF-α升高,对IL-6表达有降低趋势,但是统计学上无显著性差异(P＞0.05)。　　 3.2小胶质细胞功能性阻断剂Minocycline对创伤应激和电针大鼠小胶质细胞TLR2/4及炎性细胞因子表达的影响　　 3.2.1Minocycline对创伤应激和电针后小胶质细胞数目的变化　　 创伤应激大鼠24h后小胶质细胞总数明显增加,为191.7±10.8(×104),造模前1h给予小胶质细胞功能性阻断剂Minocycline,创伤应激大鼠小胶质细胞数量为158.0±8.0(×104),与创伤组相比,统计学上有显著性差异(P＜0.001)。Minocycline+电针组小胶质细胞数量为148.5±11.4(×104)(P＜0.001,与创伤应激组相比),说明小胶质细胞抑制剂和电针能抑制创伤应激导致的中枢小胶质细胞数量增多。　　 3.2.2Minocycline对创伤应激和电针后小胶质细胞TLR2、TLR4表达的影响　　 创伤应激24h后大鼠小胶质细胞表面TLR2和TLR4表达明显升高(P＜0.01,P＜0.01,与对照组相比),Minocycline能显著降低创伤应激后小胶质细胞表面表达TLR2和TLR4(P＜0.01,P＜0.05,与创伤应激组相比),电针和Minocycline合用可以抑制创伤应激后小胶质细胞表达TLR2和TLR4,但是和单用Minocycline相比无显著性差异。　　 3.2.3Minocycline对创伤应激和电针大鼠小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响　　 Minocycline阻断创伤应激引起的IL-1β、IL-6和TNF-α表达,电针和Minocycline合用也能完全阻断创伤应激导致的炎性细胞因子表达。　　 3.3Minocycline对创伤应激大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响　　 创伤应激后24h取脾脏,分离脾脏单个核细胞,检测ConA刺激的淋巴细胞增殖反应,结果显示,创伤应激24h后大鼠脾脏淋巴细胞增殖能力受到明显抑制(P＜0.01)。Ip.Minocycline能部分阻断由创伤应激造成的脾脏淋巴细胞增殖能力降低,与创伤组相比有明显改善(P＜0.05),但与正常对照组相比仍有一定程度的抑制(P＜0.05)。提示小胶质细胞参与创伤应激诱导的免疫抑制,抑制小胶质细胞功能能改善创伤后免疫状态。　　 小结:　　 上述实验结果提示,创伤应激直接激活小胶质细胞,表现为小胶质细胞数量增多,细胞表面TLR2、TLR4表达增加,炎性细胞因子表达增加。电针能抑制小胶质细胞的激活。小胶质细胞参与创伤应激引起的免疫抑制。　　 四、β-肾上腺素能受体在创伤应激大鼠中枢小胶质细胞激活中的作用　　 4.1β-肾上腺素能受体阻断剂对创伤应激大鼠小胶质细胞TLR及炎性细胞因子表达的影响　　 β-肾上腺素能受体阻断剂可以抑制创伤大鼠下丘脑组织TLR和炎性细胞因子的表达,是否是通过直接抑制了小胶质细胞的活化。大鼠在创伤应激前30minip.注射propranolol,创伤后24h灌流取脑,分离小胶质细胞,检测小胶质细胞数量,TLR2、TLR4表达和IL-1β,IL-6,TNF-α表达。　　 4.1.1β-肾上腺素能受体阻断剂对创伤应激后小胶质细胞数目的变化　　 创伤应激大鼠24h后小胶质细胞总数明显增加,为191.7±10.8(×104),事先运用β-肾上腺素能受体阻断剂propranolol后,创伤应激大鼠小胶质细胞数量为188.0±18.0(×104)(P＞0.05,与创伤应激组相比)。说明β-肾上腺素能受体对小胶质细胞数量无显著性影响。　　 4.1.2β-肾上腺素能受体阻断剂对创伤应激后小胶质细胞TLR2、TLR4表达的影响　　 创伤应激24h后大鼠小胶质细胞表面TLR2和TLR4表达明显升高(P＜0.01,P＜0.01),β-肾上腺素能受体阻断剂能显著降低创伤后小胶质细胞表面表达TLR4(P＜0.05),对TLR2的表达无显著性影响。提示β-肾上腺素能受体参与对小胶质细胞表达TLR的调控。　　 4.1.3β-肾上腺素能受体阻断剂对创伤应激大鼠小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响　　 创伤应激24h后大鼠小胶质细胞IL-1β,IL-6,TNF-α蛋白表达在创伤后均有不同程度的升高(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05与正常对照组相比)。Propranolol抑制由创伤应激引起的IL-1β和IL-6升高,对TNF-α表达有降低趋势,但是统计学上无显著性差异(P＞0.05)。　　 4.2β-肾上腺素能受体激动剂对离体培养的小胶质细胞TLR及细胞因子合成的影响　　 4.2.1β-肾上腺素能受体激活对离体培养的小胶质细胞TLR2/4及炎性细胞因子合成的影响　　 由于β-肾上腺素受体阻断剂能阻断创伤应激诱导的小胶质细胞合成IL-1β和IL-6,本实验在培养的小胶质细胞上加入1uMβ-肾上腺素受体激动剂Iso后,收集刺激前以及刺激后2h、6h、12h、24h的细胞和上清液,提取细胞总RNA,观察激动β-肾上腺素受体后能否直接刺激小胶质细胞合成TLR和炎性细胞因子。结果显示,1uMβ-肾上腺素受体激动剂Iso不影响TLR2/4的表达,各处理组之间无统计学差异。　　 但是,1uMβ-肾上腺素受体激动剂Iso显著增加IL-1β,TNF-α和IL-6mRNA合成,炎性细胞因子表达的达峰时间各不相同,IL-1β mRNA在Iso刺激后2h合成达到峰值,IL-6和TNF-α mRNA的达峰时间分别为刺激后6h和12h。炎性细胞因子mRNA合成增加的同时,蛋白表达水平也发生相应的变化,IL-1β在Iso刺激后6h即检测到增加,刺激后12h分泌达到峰值,24h后恢复至刺激前水平。IL-6的分泌在Iso刺激后2h即检测到增加,刺激后6h分泌达到峰值,刺激后12h恢复至刺激前水平。TNF-α的合成迟于IL-1β和IL-6,Iso刺激12h后检测到增加,24h后仍然在继续升高。结果提示激活小胶质细胞上的β-AR能刺激炎性细胞因子分泌。　　 4.2.2β-肾上腺素能受体激动剂剂量依赖性增加小胶质细胞IL-1βmRNA合成　　 小胶质细胞在不同剂量Iso刺激下,收集2h后的细胞,用Real-Time PCR方法检测细胞IL-1β表达水平。结果显示,在0.01μM、0.1μM、1μM、10μM不同浓度Iso作用下,IL-1β mRNA合成呈剂量依赖式增加。　　 4.2.3β-肾上腺素能受体激动剂诱导小胶质细胞IL-1βmRNA合成的信号转导机制　　 β-肾上腺素受体激活后可以通过PKA经典途径激活下游信号转导通路,也有实验表明,β-受体激活后通过MAPK信号转导途径促进细胞因子分泌。本实验在离体培养的小胶质细胞,运用H89(PKA阻断剂),U0126(p-ERK抑制剂),SB203580(p-P38抑制剂)和SP600125(p-JNK抑制剂)等药物干预,观察Iso对小胶质细胞合成细胞因子的影响。小胶质细胞经1μMIso刺激后,收集刺激前和刺激5min、15min、30min和60min的细胞,用WesternBlot方法分析ERK1/2,p38和JNK的蛋白磷酸化变化,结果显示1μMIso刺激5min后,磷酸化p-ERK表达明显增加,刺激后15min仍维持在较高水平,刺激后30min基本恢复正常。磷酸化p38和p-ERK呈现相同的变化趋势,1μMIso刺激后5min开始增加,刺激后15min达到峰值,刺激后60min恢复正常。磷酸化JNK1/2在1μMIso刺激后无显著性变化。小胶质细胞预先用不同的抑制剂,包括H89(10μM,PKA inhibitor),U0126(10μM,ERK1/2 inhibitor),SB203580(10μM,P38 inhibitor),或SP600125(10μM,JNK inhibitor),预处理30min后,再加入1μMIso刺激2h,收集细胞,经real-timePCR检测IL-1βmRNA表达情况,结果显示,1μMIso刺激诱导的IL-1β mRNA表达可以被U0126和SB203580所阻断,但是不能被H89和SP600125所阻断。提示Iso诱导的细胞因子表达是通过ERK1/2和P38信号转导途径,而非PKA或INK信号转导通路。　　 小结:　　 创伤应激导致的小胶质细胞激活部分是由中枢β-肾上腺素能受体介导的。综上所述,本论文获得以下结论:　　 (1)创伤应激可导致大鼠外周TLR2/TLR4激活,炎症反应增强,电针通过抑制创伤应激后的交感神经活动改善创伤后免疫功能紊乱。肾上腺不参与电针调节创伤应激后机体的炎症反应。　　 (2)创伤应激直接激活小胶质细胞,表现为小胶质细胞数量增多,细胞表面TLR2、TLR4表达增加,炎性细胞因子表达增加。小胶质细胞的激活参与创伤应激引起的免疫抑制。电针能抑制小胶质细胞的激活,这可能是电针改善免疫功能的作用途径之一。　　 (3)创伤应激导致的小胶质细胞激活部分是由中枢β-肾上腺素能受体介导的。