【摘 要】
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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）,牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）和牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）是引起牛腹泻疾病的三种主要病原,混合感染频率较高、临床症状相似不易区分,建立一种BVDV、BRV和BCoV的检测方法势在必行。为此,本研究根据BVDV 5′-UTR、BRV NSP5和BCoV N基
【基金项目】
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内蒙古自治区科技重大专项（No.2020ZD0006）；
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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）,牛轮状病毒（Bovine rotavirus,BRV）和牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）是引起牛腹泻疾病的三种主要病原,混合感染频率较高、临床症状相似不易区分,建立一种BVDV、BRV和BCoV的检测方法势在必行。为此,本研究根据BVDV 5′-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列分别设计合成特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测三种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法;根据BVDV 5′-UTR、BRV VP7和BCoV N基因序列设计合成三对特异性引物和三条特异性探针,选用三种颜色编码磁性微球分别与特异性探针进行偶联,通过优化反应体系和条件,建立了BVDV、BRV、BCoV三重液相芯片检测方法,并对两种方法的敏感性、特异性、重复性、符合率和临床应用性能进行了验证。结果表明,三重RT-qPCR方法仅对BVDV、BRV和BCoV扩增呈阳性,而对其它与犊牛腹泻相关参考病原的扩增呈阴性;最低检出限均为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%;利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份牛粪便拭子临床样品进行检测并与已报道的单重RT-qPCR方法进行比较,符合率分别为100%（BVDV）、96.5%（BRV）、100%（BCoV）。三重液相芯片检测方法可特异性的检测BVDV、BRV和BCoV,BVDV与BRV最低检出限均为103拷贝/μL,BCoV最低检出限为102拷贝/μL;利用本研究建立的三重液相芯片方法对44份临床样品进行核酸检测,并将本研究建立的三重液相芯片检测结果与本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR检测结果进行比较,符合率分别为95.5%（BVDV）、88.6%（BRV）、88.6%（BCoV）。研究结果证明,本文所建立的两种方法敏感性高、特异性强、重复性好,具有良好的应用前景,研究结果也将为BVDV、BRV和BCoV混合感染的早期诊断及防空工作提供可靠的检测手段。
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