胚胎发育是植物个体发育过程中最重要的阶段之一,它关系着种子能否正常形成,亲代的遗传性状能否顺利地传递给下一代,同时也是子代生长发育的重要保证。合子到球形胚的早期胚胎发育又是整个发育过程中非常重要的阶段。这期间,胚胎将完成极性的确立、细胞命运的决定等关键步骤。在小鼠的研究中,人们发现SMC(Structural Maintenance of Chromosome)6 的突变影响了 胚胎的发育;而在酵母和人类细胞中的研究则表明SMC5/6复合体广泛地参与了细胞内基因组稳定性的维持。尤其对该复合体在DNA损伤修复过程中的功能有了比较清晰的认识。但是,在植物中该复合体的生物学功能少有报道。尤其是对于AtNSE(Non-SMC element)1和AtNSE3两个亚基在植物生长发育过程中发挥的功能并不了解。在本研究中,我们以AtNSE1和AtNSE3的4个突变体为主要的实验材料,利用杂交技术、荧光定量PCR、原位杂交、胚珠透明、遗传转化、酵母双杂交、BiFC、细胞超薄结构观察、流式细胞仪分析、彗星实验等遗传学、细胞生物学以及分子生物学手段,揭示了拟南芥中AtNSE1和AtNSE3可以促进有丝分裂过程中DNA损伤的修复,并对正常的细胞周期的维持以及细胞活力、细胞分裂活性的维持起到重要作用,对于早期胚胎发育和胚后发育具有重要意义。获得的主要结果如下:1.从拟南芥突变体库ABRC和NASC中获得了AtNSE 和AtNSE3的4个T-DNA插入突变体,分别命名为nse1-1,nse1-2,nse3-1以及nse3-2。对它们进行纯杂合鉴定,发现它们均为杂合体,且后代中仍无纯合体出现。杂合体角果中具有约25%的白色异常胚珠,最终败育。遗传分析显示,这4个突变体的配子体遗传传递率与野生型并无差别,但是自交后代分离比中含T-DNA插入与不含插入的比值均约为2:1,暗示它们可能是胚胎纯合致死突变体。回复实验结果显示突变体的表型获得恢复,表明AtNSE1和AtNSE3的缺失突变是造成种子败育的原因。2.对4个突变体进行胚珠透明观察,发现异常胚胎均在8-细胞原胚时期之后开始出现细胞分裂异常的现象,并且随着发育过程的进行,胚胎细胞分裂越来越紊乱,胚柄细胞后期也出现了异常的分裂。统计异常胚胎的比例,发现均为25%左右,这与杂合突变体的角果中败育率是一致的。同时还观察了突变体胚珠中胚乳细胞的发育,结果发现胚乳细胞细胞核的形状和大小均出现异常,暗示其DNA的含量可能发生了改变。nse1-1 nse3-1双突变结果显示,其后代的胚胎发育缺陷表型与单突变一致,双杂合突变株败育率为43.65%,符合孟德尔遗传定律(42.75%)。以上结果表明,AtNSE1与AtNSE3的缺失不仅造成了早期胚胎的发育缺陷,同时也一定程度上影响了胚乳的发育。3.采用瞬时表达分析,结果显示AtNSE1和AtNSE3均定位于细胞核中。通过酵母双杂交和BiFC证实两者之间可以直接发生互作。利用荧光定量PCR和原位杂交技术检测了 AtNSE1和AtNSE3在组织中的表达,结果显示两者表现出非常类似的表达模式,尤其是在胚胎中的表达分布比较相似,这暗示了它们可能具有相似的功能,也更加印证了它们是以复合体发挥作用的。同时,结合序列和结构保守性分析来看,推测AtNSE1和AtNSE3可能具有各物种间保守的生物学功能。4.利用胚胎特异表达marker的杂交分析技术,显示出STM表达严重异位,WOX5表达范围扩大,而WOX8表达范围则缩小,PIN1与DR5表达也出现异常。这些结果表明胚胎的胚体器官原基分化异常,胚柄上部分细胞失去原本功能,推测胚体和胚柄的发育命运可能发生了转变。5.利用ABI3启动子驱动AtNSE1和AtNSE3的表达,可以分别部分地回复nse1-1和nse3-1的败育胚胎的表型。但是,部分回复的纯合突变体仍然表现出植物根的生长受到明显抑制,细胞分裂活性明显降低,茎顶端第二对真叶无法正常分化,幼苗整体生长缓慢,最终死亡。染色体在分裂后期表现为异常的分离,出现断裂的染色体;G2期到M期的转换受到一定的抑制,流式分析显示,DNA水平>4C的细胞比例升高,暗示部分细胞经历了复制但没有分裂,因此核内复制频率增加。转录组测序分析结果显示,纯合胚珠中调控器官分化和组织发育的相关基因显著下调,而DNA复制途径被显著激活。因此,AtNSE1和AtNSE3的缺失引起有丝分裂异常,细胞周期的停滞,从而影响细胞分裂活性,最终抑制胚后的幼苗发育。6.利用彗星实验技术,发现AtNSE1和AtNSE3基因的突变引起细胞内DSB(double strand break)的积累。利用部分回复突变体植株对DNA损伤剂MMS应答,结果表现出比野生型更加敏感,并且AtNSE1和AtNSE3的表达也因DSB诱导剂的处理而上调表达。转录组测序结果也显示,在突变体胚珠中同源重组修复途径相关基因被显著激活。这些结果表明AtNSE1和AtNSE3基因参与了体细胞生命活动中产生的DSB的修复过程。利用PI和FDA双染胚胎和部分回复纯合体幼苗根尖,发现DSB在突变体细胞中的积累也引起了细胞凋亡的发生。超微结构的结果显示,由于AtNSE1和AtNSE3基因的突变,细胞发生了泡状化的PCD和necrosis两种程序性死亡途径,这是导致胚胎败育和幼苗死亡的最主要原因。