骨肉瘤(osteosarcoma)是儿童和青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤。20世纪70年代以前,主要治疗方法是截肢和关节离断,从外科治疗到出现肺转移的平均时间为8个月,5年生存率<25%。随着外科技术和影像学的发展,新辅助化疗和免疫治疗的进步,骨肉瘤治愈率有了明显改进,5年生存率达到80%。但目前的治疗手段仍无法解决肿瘤病人的转移、复发和药物耐药等情况,肿瘤的基因靶向性分子治疗的出现为骨肉瘤的治疗开辟了一条新的治疗途径。Bid(BH3-interacting domain death agonist)是一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族成员蛋白,全长为195aa,分子量为22kDa。Bid位于细胞浆内,在死亡受体介导的细胞凋亡信号途径中,可引起Caspase-8聚集活化,活化的Caspase-8切割Bid,去除N末端片段,形成活性的截短的Bid ( truncated Bid,tBid)分子。tBid的分子量为15kDa,从细胞浆转位到线粒体中,通过调节细胞色素c(Cyt c)释放和其他线粒体凋亡分子调节凋亡过程。HER2/neu分子是癌基因erbB2的编码产物,其编码基因定位于人染色体17q21,是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白,是表皮生长因子(EGF)受体家族的成员之一。通常情况下,HER2/neu只在胎儿时期表达,到成年以后,仅有低水平表达于细胞表面。HER2/neu的过度表达存在于多种肿瘤组织,如转移性乳腺癌(25%-30%)、炎症性乳腺癌(50%)、转移性导管癌(60-70%)、非小细胞肺癌(13-55%)、卵巢癌(18-43%)、子宫内膜癌(10-52%)、直肠结肠癌(33-85%)、肾癌(22-36%)、头颈癌(16-50%)、胃癌(21-64%)、食道癌(10-26%)、前列腺癌(5-46%)等。另40-44%成骨肉瘤及58%成骨肉瘤肺转移等,成为一种公认的肿瘤标志物。本研究将信号肽、单链抗体、来源于绿脓杆菌的具有膜转位作用的肽段和tBid融合,构建分泌型靶向促凋亡分子Immuno-tBid(pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-tBid61,即pCMV-5-2),使其能特异性识别、内化并转位进入细胞液中,诱导HER2阳性的肿瘤细胞凋亡。首先采用脂质体转染法将tBid基因转染骨肉瘤细胞系SOSP-9607,通过间接免疫荧光法、流式细胞仪及电镜等方法,对tBid的促调亡活性进行了检测。实验结果显示tBid在骨肉瘤细胞中能够有效得到表达,转染pcDNA3空载体的对照组细胞形态正常,细胞膜完整,而转染pcDAN3-tBid61的实验组细胞则变得较少,形态发生改变,体积变小并且固缩。对转染细胞进行电镜观察,发现细胞膜出胞,胞核浓缩,染色质聚集等凋亡特征。使用流式细胞仪、Annexin V和PI双染,监测细胞膜表面磷脂酰丝氨酸外翻情况,结果表明,与对照组细胞(6%)相比,实验组早期调亡和凋亡继发死亡率为35.8%。进一步采用脂质体转染法将重组的活性tBid融合蛋白基因(pCMV-5-2)转染HER2阳性骨肉瘤SOSP-9607细胞,观察其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的凋亡诱导作用。通过间接免疫荧光的方法从细胞形态学的变化来检测凋亡,观察到转染目的基因后有细胞固缩、核浓缩等凋亡特征。进一步通过Annexin V染色、流式细胞仪检测,与对照组细胞(6%)相比,凋亡率为42%,表明细胞膜表面有磷脂酰丝氨酸外翻,说明重组Immuno-tBid基因表达后有促凋亡作用。将pCMV-5-2基因用脂质体包裹,肌肉注射荷有HER2阳性骨肉瘤(SOSP-9607)的裸鼠,可观察到治疗组瘤体生长速度慢于对照组。免疫组织化学结果显示,Immuno-tBid蛋白选择性地分布于治疗组裸鼠的肿瘤组织和肌肉组织中,其他组织如心、肝、脾、肺、肾脏中,以及在对照组肿瘤组织中,染色呈阴性或弱阳性,后者可能是内源性Bid表达的结果。进一步对肿瘤组织进行TUNEL染色,可检测到治疗组的肿瘤细胞呈现TUNEL阳性。以上结果表明Immuno-tBid选择性地分布于HER2阳性的肿瘤组织中,并通过引起肿瘤细胞凋亡而有效地杀灭肿瘤。综上所述,Immuno-tBid基因导入机体细胞后,可以靶向杀伤HER2阳性的骨肉瘤细胞,可望为HER2阳性骨肉瘤治疗提供一种新的思路。