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目的:Cyclin G2为非经典细胞周期蛋白,家族成员还包括cyclin I和cyclin G1。大量证据表明cyclin G2在癌症的发展中发挥重要作用,在多种癌症中cyclin G2的表达均下调。本实验室前期的研究结果证实,cyclin G2能够抑制经典Wnt信号通路从而参与骨代谢的调节。经典Wnt信号通路参与细胞增殖、分化、存活、凋亡及细胞迁移等多种功能调节,在胚胎发育、肿瘤发生和器官纤维化等重要生理及病理过程中发挥重要作用。有证据表明,高糖诱导可以激活肾小球足细胞和系膜细胞中经典Wnt信号通路,而抑制经典Wnt信号通路有助于改善I型糖尿病患者的蛋白尿和肾纤维化。糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病的常见并发症,是引起终末期肾衰的重要原因之一,DN的病理特征首先表现为肾小球肥大,肾小球肾小管细胞膜、基底膜增厚及细胞外基质堆积,随后导致肾小管间质纤维化及肾小球硬化。临床结局往往表现为渐进不可逆的肾功能障碍,最终造成肾衰竭。近来越来越多的证据表明多种细胞因子及信号通路参与了DN的发病过程,其中Wnt信号通路能够参与多种肾损伤和肾间质纤维化过程,而肾间质纤维化是导致DN的主要病理基础,这表明经典Wnt信号通路在DN的发生发展中可能发挥了关键作用。本研究采用多种分子细胞生物学手段研究了cyclin G2在体外细胞水平和体内动物水平参与DN发生的病理过程,并深入探讨cyclin G2调节DN的作用途径与机制,证明cyclin G2通过调节经典Wnt信号通路参与DN的肾小球硬化和肾间质纤维化发生发展机制,揭示了cyclin G2参与糖代谢异常疾病发生发展进程新的生物学功能。研究方法:1、Cyclin G2过表达调节肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞中肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白作用的研究应用肾小球系膜细胞(HMC)和肾小管上皮细胞(HK-2)细胞感染CCNG2慢病毒后,提取细胞总蛋白,通过western blot实验检测肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白表达。2、Cyclin G2通过经典Wnt信号通路调节细胞肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达的研究应用GSK3β抑制剂CHIR99021处理感染CCNG2慢病毒的HMC和HK-2细胞72 h,提取细胞总蛋白,检测加入抑制剂前后cyclin G2对经典肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达影响的变化。3、Cyclin G2调节经典Wnt信号通路的机制研究应用HMC和HK-2细胞,采用免疫共沉淀和Duolink in situ PLA实验方法验证cyclin G2和Dapper1(Dpr1)的相互结合作用;在HMC和HK-2细胞中转染cyclin G2真核表达载体或对照载体,通过Dpr1抗体进行免疫共沉淀,用磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体进行western blot实验,检测过表达cyclin G2对Dpr1磷酸化的影响;在HMC和HK-2细胞中转染cyclin G2真核表达载体或对照载体,通过Duolink in situ PLA实验检测过表达cyclin G2对CK1和Dpr1结合作用的影响;在HMC和HK-2细胞中转染cyclin G2真核表达载体和CK1真核表达载体或对照载体,通过免疫共沉淀实验检测cyclin G2影响CK1对Dpr1的磷酸化作用;在HMC和HK-2细胞中转染cyclin G2真核表达载体和Dpr1(野生型或突变型)真核表达载体或对照载体,通过western blot实验检测共转染cyclin G2和野生型或突变型Dpr1后,对经典Wnt信号通路下游蛋白的影响。4、Cyclin G2过表达对高糖诱导的肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白以及经典Wnt信号通路蛋白表达影响的研究应用高糖和低糖培养基条件培养感染CCNG2慢病毒的HMC和HK-2细胞72h,提取总蛋白,通过western blot方法检测肾小球硬化和间质纤维化以及经典Wnt信号通路相关蛋白表达;应用免疫荧光检测纤维化相关蛋白表达。5、构建cyclin G2敲除糖尿病肾病小鼠模型检测cyclin G2对糖尿病肾病小鼠中蛋白尿和肾损伤影响的研究采用免疫组化和western blot检测cyclin G2在野生小鼠和糖尿病肾病小鼠肾组织中表达变化;应用STZ诱导的野生糖尿病肾病小鼠和cyclin G2敲除糖尿病肾病小鼠,使用代谢笼收集小鼠24 h尿液,采用试剂盒检测尿肌酐和尿白蛋白;采用periodic acid-Schiff(PAS)染色检测肾组织基底膜厚度;采用Masson染色检测肾组织胶原纤维含量。6、构建cyclin G2敲除糖尿病肾病小鼠模型研究和验证cyclin G2调节肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白的作用及机制采用免疫组化和western blot方法检测野生糖尿病肾病小鼠和cyclin G2敲除糖尿病肾病小鼠肾组织肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白以及经典Wnt信号通路蛋白的变化。结果:1、Cyclin G2在体外抑制肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白表达在HMC和HK-2细胞中感染CCNG2病毒后,用western blot检测肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白表达,结果显示cyclin G2过表达的细胞(LV-CCNG2)中N-cadherin、vimentin、Endothelin-1(ET-1)、Fibronectin(FN)、Collagen IV相比对照组(LV-GFP)表达显著下调(p<0.05),E-cadherin表达上调(p<0.05);cyclin G2过表达的细胞中检测到经典Wnt信号通路的关键蛋白β-catenin及其靶蛋白cyclin D1、c-Myc、MMP7表达下调。同时磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)表达上调,磷酸化GSK3β(Ser9)表达下调。表明cyclin G2可以抑制肾小球硬化和间质纤维化蛋白表达,并负性调节经典Wnt信号通路。2、Cyclin G2在体外通过经典Wnt信号通路抑制肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达应用GSKβ抑制剂CHIR99021激活HMC和HK-2细胞的经典Wnt信号通路,结果发现加入CHIR99021处理前cyclin G2过表达可以抑制经典Wnt信号通路蛋白和肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达。而加入CHIR99021后经典Wnt信号通路蛋白和肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达升高,但cyclin G2过表达对经典Wnt信号通路相关蛋白的抑制作用受到阻断,同时cyclin G2对肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白下调和E-cadherin上调作用也减弱或消失。提示cyclin G2可通过经典Wnt信号通路调节肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白的表达。3、Cyclin G2与Dpr1结合影响CK1对Dpr1 Ser762磷酸化,从而抑制经典Wnt信号通路免疫共沉淀和Duolink in situ PLA实验结果显示cyclin G2与Dpr1有相互结合作用。免疫共沉淀结果显示cyclin G2过表达后Dpr1的磷酸化水平降低;Duolink in situ PLA实验结果显示,cyclin G2过表达后CK1与Dpr1结合减少;转染CK1后Dpr1的磷酸化上调,而共转染CK1和cyclin G2后,Dpr1的磷酸化水平下调。转染野生型和突变型Dpr1表达载体,β-catenin在转染野生型Dpr1的时候表达降低,β-catenin和下游靶蛋白表达则升高。4、Cyclin G2抑制高糖诱导的经典Wnt信号通路蛋白和肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达应用高葡萄糖条件培养HMC和HK-2细胞72 h,western blot结果显示细胞中N-cadherin、ET-1、FN、vimentin、Collagen IV肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达相比低糖对照组上调,E-cadherin表达下调。而过表达cyclin G2可以抑制高葡萄糖诱导的N-cadherin、ET-1、FN、vimentin、Collagen IV蛋白表达上调;免疫荧光实验显示cyclin G2可以抑制高葡萄糖诱导下N-cadherin表达升高;高糖培养下的HMC和HK-2细胞中β-catenin、cyclin D1、c-Myc、MMP7表达上调,而过表达cyclin G2可以抑制高葡萄糖诱导的β-catenin、cyclin D1、c-Myc、MMP7蛋白的高表达。5、Cyclin G2敲除影响糖尿病肾病小鼠的蛋白尿和肾损伤免疫组化结果显示在糖尿病肾病小鼠中cyclin G2表达低于野生小鼠。Cyclin G2敲除的糖尿病肾病小鼠24 h尿白蛋白高于野生糖尿病肾病小鼠;尿肌酐/白蛋白比也高于野生糖尿病肾病小鼠。PAS染色结果显示cyclin G2敲除的糖尿病肾病小鼠肾组织中肾小球基底膜厚度高于野生糖尿病肾病小鼠;Masson染色结果显示cyclin G2敲除的糖尿病肾病小鼠肾组织中肾皮质中胶原纤维含量高于野生糖尿病肾病小鼠。提示cyclin G2敲除的糖尿病肾病小鼠有更严重的蛋白尿、肾损伤以及肾纤维化。6、在cyclin G2敲除的糖尿病肾病小鼠中验证cyclin G2调节肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白表达采用免疫组化和western blot结果显示cyclin G2敲除糖尿病肾病小鼠肾组织中肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达以及经典Wnt信号通路蛋白表达均高于野生糖尿病肾病小鼠。结论:1、Cyclin G2在体外可通过经典Wnt信号通路调节肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达。2、Cyclin G2在体外可抑制高糖诱导的肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白表达。3、Cyclin G2在体内抑制糖尿病肾病小鼠的肾组织中肾小球硬化和间质纤维化相关蛋白和经典Wnt信号通路蛋白表达,对肾损伤和肾纤维化有保护作用。