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中国猪瘟兔化弱毒（脾淋毒）全长感染性cDNA的克隆和构建，可以使我们得到纯粹的CSFV C-株RNA病毒基因组，在DNA水平上研究和利用CSFV的基因突变、缺失、插入和替换。为进一步研究CSFV的复制机理、毒力及其决定因素、致弱机制、致病机理、基因产物的功能、特异性诊断、宿主嗜性以及DNA疫苗开发、标记疫苗的生产等方面的研究，打下了坚实的基础，并为众多病毒分子生物学研究工作者提供极为有价值的研究工具。主要研究内容包括： 1．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）基因组cDNA文库的构建、序列分析：根据已发表的猪瘟病毒（CSFV）核苷酸序列，借助计算机软件分析，选择高保守区段和基因组中的单一限制性酶切位点，利用RT-PCR及nested-PCR和Helf-nested PCR技术，成功地扩增出了覆盖C-株全基因组的7个cDNA重叠片段F1～F7，分别克隆到pMD-18T或pGEM-T Easy载体进行测序后，拼接出了其核苷酸序列。与国内外已发表的CSFV Shimen株、Berscia株、Cap株、Eystrup株、F114株、Glentorf株、Riems株、Russia C株和Alfort株进行了序列比较。 2．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）全长-cDNA的分子克隆：通过基因改造，将T7 RNA聚合酶启动子和目的片段连接过程中起辅助作用的限制性内切酶识别位点各自导入相应的cDNA重叠片段末端。将F3、F4 PCR产物，采用Acc Ⅲ酶切后与pMD-18T载体置同一体系中连接，获得连接片段F3-F4的重组质粒pMD-18T／F34。再将重组质粒pMD-18T／F1采用NotⅠ和PvuⅠ双酶切，重组质粒pGEM-T Easy／F2采用PvuⅠ和NsiⅠ双酶切，重组质粒pMD-18T／F34采用NsiⅠ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，获得5′半长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-4，长度为6517bp。将重组质粒pMD-18T／F5采用NotⅠ和FspⅠ双酶切，重组质粒pMD-18T／F6采用FspⅠ和Csp45Ⅰ双酶切，重组质粒pMD-18T／F7采用Csp45Ⅰ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，获得3′半长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F5-7，长度为5940bp。最后，将重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-4采用NotⅠ和SplⅠ双酶切，重组质粒pGEM-5zf（+）／F5-7采用SplⅠ和SalⅠ双酶切，载体pGEM-5zf（+）采用NotⅠ和SalⅠ双酶切，分别回收各目的片段，于同一体系中连接，得到基因组全长cDNA重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-7。T-A克隆的巧妙运用和多片段一步连接法的成功运用是全长cDNA得以快速构建的主要原因。 3．中国猪瘟兔化毒（脾淋毒）全长cDNA感染性的初步鉴定：利用限制性内切酶SrfⅠ将重组质粒pGEM-5zf（+）／F1-7线性化，以产生精确的基因组3′末端。以线性化的全长cDNA为模板，体外转录得到了CSFV基因组RNA。采用TransFastTM Reagent脂质体转染试剂将基因组RNA转染到SK-6贴壁细胞。连续传代5代以后，收集各W摘要代细胞至第10代，采用RT一PCR、直接荧光抗体染色和夹心ELISA技术进行鉴定，结果均为阳性。表明利用反向遗传技术，可以从猪瘟病毒C一株的基因组RNA获得C一株重组病毒。这一技术为众多病毒分子生物学研究领域提供了极为有价值的研究工具。