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金属硫蛋白（Metallothionein,MTs）是一类低分子量且富含半胱氨酸的金属结合蛋白,在保持体内必需金属元素平衡以及解除重金属毒性方面起重要作用。本课题组前期从河南华溪蟹（Sinopotamon henanense）中成功克隆出镉诱导的MT cDNA全长。为提高MTs的金属结合效率以及深入研究MTs的金属结合特性,实验采用基因串联方法,利用重叠延伸PCR（SOE-PCR）技术将两个和三个拷贝的蟹MT基因串联整合,生物合成2MT、3MT基因片段;利用SUMO融合表达系统构建pET28a-SUMO-2MT、pET28a-SUMO-3MT重组表达质粒,以增加重组蛋白的稳定性和溶解度;亲和层析纯化得到的融合蛋白SUMO-MT、SUMO-2MT、SUMO-3MT经Tris-HCl缓冲液脱盐、超滤管浓缩,与体外金属再生,紫外光谱扫描检测金属簇吸收峰;最后,采用火焰原子分光光度法检测转MT、2MT、3MT工程菌富集Cu2+、Cd2+、Zn2+重金属离子的能力;通过药敏实验和菌体生长曲线测定,检测转MT、2MT、3MT工程菌对Cu2+、Cd2+、Zn2+重金属离子的耐受能力。研究结果如下:1.河南华溪蟹金属硫蛋白串联表达载体的构建DNA测序证实,经SOE-PCR技术扩增得到的2MT、3MT基因片段不存在核苷酸替换、无突变。实验表明,重组质粒pET28a-SUMO-2MT和pET28a-SUMO-3MT构建成功。2.河南华溪蟹金属硫蛋白串联体的优化表达与纯化实验通过对诱导条件的筛选,优化了SUMO原核表达系统,最终确定融合蛋白SUMO-MT、SUMO-2MT和SUMO-3MT的最适诱导条件分别为37℃,1mM IPTG、30℃,0.7 mM IPTG、30℃,0.7 mM IPTG。诱导8 h后,融合蛋白获得可溶性表达,其分子质量分别约为28 kDa、36 kDa和42 kDa。SDS-PAGE检测结果证明蛋白纯化效果良好,已去除大部分杂蛋白;紫外分光光度计分别在220 nm、245 nm、270 nm波长处检测到了特殊的金属簇吸收峰,证明apo-MT、apo-2MT、apo-3MT具有与Zn、Cd和Cu结合的能力。3.转金属硫蛋白及其串联体工程菌对重金属的富集与耐受火焰原子分光光度计检测结果显示:转MT、2MT、3MT工程菌对Cu、Cd、Zn的富集作用均极显著高于野生菌（P<0.01）,且对重金属的富集强度依次为转3MT工程菌?转2MT工程菌?转MT工程菌?野生菌。转3MT工程菌对Cu、Cd和Zn的生物富集能力分别是野生菌的5.8倍、3.1倍和6.7倍。药敏实验结果显示:与野生菌相比,转MT工程菌、转2MT工程菌和转3MT工程菌对不同浓度的Cu、Cd、Zn均具耐受性,且转3MT工程菌对重金属的耐受能力最强。转工程菌生长曲线测定结果显示:转MT工程菌、转2MT工程菌和转3MT工程菌在不同时间段测定得到OD600数值均明显高于野生菌,在重金属Cu、Cd、Zn的胁迫下,各工程菌的生长繁殖能力依次为:转3MT工程菌?转2MT工程菌?转MT工程菌?野生菌。以上研究结果证明:MTs串联重组体的可溶性表达可显著增强工程菌对Cu、Cd和Zn的富集和耐受。研究结论如下:本研究通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）成功串联了两个和三个拷贝的蟹MTs基因,并在大肠杆菌中表达。通过SUMO融合表达系统,增加了重组串联SUMO-MTs的可溶性表达。MTs基因的串联表达显著增强了工程菌对重金属的生物富集能力,同时也显著增强了重组工程菌的金属耐受性。结果表明,转蟹多拷贝金属硫蛋白工程菌可以作为重金属污染生物修复的候选材料。