谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferases, GSTs, EC2.5.1.18)是一种多功能的超家族酶,广泛存在于哺乳动物、昆虫、植物、真菌以及细菌等好氧生物体中。谷胱甘肽-S-转移酶在生物体内是重要的第二相解毒酶,其主要功能是对异生质或内源的有毒物质进行代谢,从而达到解毒目的。除此外,谷胱甘肽-S-转移酶还具有许多其它的功能。例如,具有过氧化酶功能,能在氧化应激环境中保护有机体；还具有异构酶功能；参与细胞生物信号通路及生物合成方面。此外,谷胱甘肽-S-转移酶能非催化性的结合和转运大量内源或异生的成分。有一类嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶在牛、大鼠、烟草天蛾、棉铃虫和柑橘凤蝶中报道。该类酶在嗅觉系统中推测的功能：一方面对有毒物质进行代谢解毒以保护嗅觉组织；另一方面参与嗅觉进程。家蚕delta亚家族谷胱甘肽-S-转移酶有4个成员,其中BmGSTd1在NCBI登录为从家蚕触角克隆得到,其编码氨基酸与烟草天蛾中鉴定的触角特异GST-msolfl在序列相似性上达到74.4%,并且在已有报道的进化树分析上,家蚕BmGSTd1、BmGSTd4与烟草天蛾的(GST-msolfl聚为一簇。基于这些线索,从家蚕谷胱甘肽-S-转移酶鉴定嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶,并进行相关功能研究。本研究,从家蚕五龄第3天幼虫不同组织的基因芯片数据分析出发,结合RT-PCR从家蚕delta亚家族谷胱甘肽-S-转移酶的4个成员中鉴定了家蚕嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶候选基因BmGSTd1和BmGSTd4。同时,对家蚕BmGSTd1进行了克隆和分析；利用原核表达、蛋白纯化等技术获得了家蚕BmGSTD1重组蛋白；利用结构生物学手段解析了BmGSTD1不结合底物和结合底物谷胱甘肽的晶体结构,并对活性位点进行分析；利用分光光度法和薄层层析法进行了功能研究。本研究的主要结果如下：1.家蚕嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶的鉴定从NCBI GenBank下载家蚕BmGSTd1、BmGSTd2和BmGSTd3的基因全长序列,并在家蚕基因组上进行BlastN比对获取3个基因的基因芯片探针号。基于家蚕五龄第3天不同组织芯片数据分析,家蚕BmGSTd1在头部高量表达,在精巢少量表达。BmGSTd2基因在雌雄头、脂肪体、中肠、血液和前中部丝腺中有表达。BmGSTd3基因在除丝腺外其它组织中具有表达。进一步进行RT-PCR验证。RT-PCR检测结果,在五龄第3天幼虫各组织中,家蚕BmGSTd1基因在雌雄头部、触角和下颚须表达,而其它组织没有表达；BmGSTd2和BmGSTd3基因在雌雄各个组织表达均有表达。BmGSTd4基因在各个组织中都未检测到表达。在成虫蛾各组织中,家蚕BmGSTd1基因在雄蛾触角中高量表达,在足、尾鞘和生殖腺有微量表达,在雌蛾触角中特异高量表达；BmGSTd2基因在雄蛾中各个组织都有表达,在雌蛾中除脂肪体外各个组织中都有表达；BmGSTd3基因表达情况和BmGSTd2基因相似；BmGSTd4基因只在雄蛾触角特异高量表达,在雌蛾各个组织中都没有表达。2.家蚕嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶的分析家蚕BmGSTd1与BmGSTd4基因都在第6号染色体同一scaffold上,两者转录方向相同。BmGSTd1的ORF长为657bp,编码218个氨基酸,预测其蛋白质分子量为25.2kDa,等电点为5.16,不含有信号肽；BmGSTd4的ORF长为738bp,编码245个氨基酸,预测其蛋白质分子量为27.7kDa,等电点为4.63,含有信号肽。结构域预测显示BmGSTD1和BmGSTD4均具有完整的谷胱甘肽N端结构域和C端结构域。BmGSTD1和BmGSTD4氨基酸序列相似性为61.2%,两者与烟草天蛾GST-msolf1氨基酸序列相似性分别为74.4%和59.1%。BmGSTD1和BmGSTD4与已报道的嗅觉相关谷胱甘肽-S-转移酶氨基酸序列比对结果显示从第50位氨基酸残基开始,序列趋于保守,特别是第50位至第190位的氨基酸残基,其中部分残基高度保守。BmGSTD与已解析结构的昆虫谷胱甘肽-S-转移酶的delta和epsilon亚家族氨基酸序列比较保守,特别是活性位点的氨基酸残基,包括催化关键残基。氨基酸序列特征分析显示BmGSTD1和BmGSTD4具有完整的二级结构基序。3.家蚕BmGSTD1的原核表达和纯化为了进一步研究基因功能,根据BmGSTd1的ORF序列设计引物进行克隆,将得到的ORF全长片段亚克隆到原核表达载体p28,经过双酶切鉴定和测序获得了原核重组表达质粒p28-BmGSTd1。重组表达质粒转化表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞,在以加入终浓度为0.2mM的IPTG,37℃培养4h诱导表达条件下获得了可溶性形式表达产物,并且特异条带在25kDa位置处,与目的蛋白预测分子质量大小相一致,获得了重组表达的BmGSTD1可溶蛋白。通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析纯化原核表达的重组BmGSTD1蛋白。以同样的方法获得了重组BmGSTD2和BmGSTD3蛋白。纯化后的蛋白浓缩后,保存在-80℃用于后续实验。4.家蚕BmGSTDl的功能以1-氯-2,4-二硝基苯为底物,通过分光光度法测定重组家蚕BmGSTD1的酶活性参数为：结合常数Km=0.28mM,最大反应速度Vmax=456.47μmol/mg/min。与已报道的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶对1-氯-2,4-二硝基苯酶动力学参数比较,重组家蚕BmGSTD1具有很好的结合常数和最大反应速度,说明其具有较好的GST活性,暗示其可能参与有毒物质的代谢解毒。以气味分子反-2-己烯醛和反苯丙烯醛为底物,在100mM NaAc,pH4.5(10%DMF)缓冲液条件下,利用薄层层析法鉴定了BmGSTD1能催化GSH与这两种气味分子反应。家蚕BmGSTd1基因在家蚕嗅觉器官中占优势表达,除了具有很好的GST活性,还能催化气味分子与谷胱甘肽反应,根据这些结果推测BmGSTD1在家蚕嗅觉系统的作用是：一方面是对有毒物质进行解毒以保护嗅觉器官；一方面是作为清道夫对进入细胞内的气味分子进行清理,维持嗅觉系统的敏感性和高效性。5.家蚕BmGSTD1的晶体结构解析将纯化获得的重组BmGSTD1蛋白浓缩至4mg/mL,利用悬滴气象扩散法,1μL蛋白溶液(含10mM DTT)与1μL蛋白结晶下槽液(含100mM NaAc, pH4.6,8%pEG4000)在16℃静置一天,获得了BmGSTD1不结合底物的晶体。为了获得BmGSTD1结合底物谷胱甘肽的晶体,在同样条件下加入5mM谷胱甘肽。获得的晶体在上海光源用X-射线衍射后收集衍射数据,衍射数据用HKL2000处理。以大劣按蚊AdGSTD5的结构(PDB ID:1R5A)为模型利用分子置换获得BmGSTD1不结合底物结构正确的解,再利用REFMAC和WinCoot进行结构模型精修。BmGSTD1结合底物谷胱甘肽的以精修后的BmGSTD1不结合底物结构为模型,进行同样处理。最后获得了家蚕BmGSTD1不结合底物和结合底物谷胱甘肽的结构。最终分辨率分别为2.51A和2.12A。家蚕BmGSTD1结构上活性形式是二聚体,衍射数据中显示一个非对称单元中存在4个分子,推测是蛋白质结晶过程中晶体堆积造成。二聚体结构中,两个亚基通过α3、α4、α5、β4的一侧和α2与β3之间的柔性区域上的氨基酸残基的相互作用形成作用界面。二聚体的界面包埋面积接近2800A2。家蚕BmGSTD1整体结构,属于经典的谷胱甘肽-S-转移酶结构。每个亚基可分为两个独立的结构域。N端结构域是βαβαββα拓扑基序的硫氧还蛋白结构,C端是由5个α螺旋以右手螺旋构成的独立结构域,两者之间由一短的柔性区域连接。谷胱甘肽-S-转移酶结构中其它的相同特征在家蚕BmGSTD1结构中也存在,如顺式构象的Pro58,引起α4螺旋中间断裂的Gly107。组成家蚕BmGSTD1的谷胱甘肽结合位点的氨基酸残基比较保守,大部分是亲水性和极性的,它们通过氢键作用对谷胱甘肽进行结合和稳定。其中的Ser14与谷胱甘肽的巯基形成3.65A的氢键,该残基是推测的起催化作用关键残基。家蚕BmGSTD1的疏水底物结合位点呈开放式,位于谷胱甘肽结合位点上方,形成一个浅的疏水通道,并存在类似大劣按蚊AdGSTD4-4结构中的芳香“拉链”结构。