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低聚果糖（Inulooligosaccharide,简称IOS）,是指蔗糖分子的果糖基通过β-2,1-糖苷键连接1-7个果糖基,聚合度3-10的低聚糖。内切菊粉酶（endoinulinase,EC 3.2.1.7）广泛存在于霉菌、酵母及细菌中,能够从菊粉链内部随机地切断β-2,1-糖苷键,降解产物主要为低聚果糖。利用内切菊粉酶酶法制备低聚果糖对于工业化大规模生产低聚果糖具有重要的应用价值。本实验室前期保存的一株产内切菊粉酶的菌株Aspergillus niger DSM 2466,产酶性能稳定。为了获得具有较高活性的内切菊粉酶,实现内切菊粉酶在工业生产中的应用,本研究运用基因工程原理,将来源于此菌株的内切菊粉酶基因在外源宿主中进行了克隆表达,并研究了重组内切菊粉酶在低聚果糖生产上的应用。主要研究结果如下:（1）以A.niger DSM 2466基因组为模板,通过PCR技术扩增得到全长为1551 bp的内切菊粉酶基因。将目的基因连接到表达载体pETDuet-1上,并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了表达。对重组菌株的诱导表达发现:在OD600 nm为0.6左右时,加入1 mmol/L的IPTG,在23 oC诱导6 h后,样品经SDS-PAGE分析,重组内切菊粉酶的分子量约为66 kDa。对酶学性质的研究发现:重组内切菊粉酶的最适反应温度为50 oC,最适pH为6.0,重组内切菊粉酶的比酶活为4.91 U/mg;Al3+、Cu2+、Ag+、Mn2+和Fe3+对其有较强的抑制作用;而Ca2+、Ni2+对内切酶有激活作用;K+和Mg2+对酶的活力无显著影响。（2）对来源于A.niger DSM 2466的内切菊粉酶基因根据宿主菌Pichia pastoris KM71的密码子偏好性进行了优化（Inuop）,并连接到表达载体pPIC9K上,重组质粒经Sac I单酶切线性化后转入P.pastoris KM71,获得重组菌P.pastoris KM71/pPIC9K-EnInuop。以甲醇为唯一碳源和诱导剂,在摇瓶中诱导表达120 h,上清液中内切菊粉酶酶活为480 U/m L。重组菌进一步在3 L发酵罐中发酵产酶,初始诱导菌浓OD600 nm为180,诱导温度28 oC,pH 5,溶氧维持在20%左右,诱导表达120 h后酶活为858 U/m L,比酶活为283.7 g/mL。（3）对重组内切菊粉酶生产低聚果糖的工艺进行了优化,在最佳反应条件（温度60 oC、pH 6.0、底物浓度400 g/L和酶用量40 U/g菊粉）下,重组内切菊粉酶酶解菊粉4 h后,低聚果糖产量达到最高,为365.1 g/L,同时低聚果糖得率为91.3%。低聚果糖的分布主要为DP（degree of polymerization）3-6,分别为8.84%GF2、18.05%GF3、30.18%F3、15.67%GF4、10.58%F4和7.97%GF5。（4）以酿酒酵母细胞壁蛋白a凝集素和Pir1为锚定蛋白,分别将内切菊粉酶展示在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母（P.pastoris）表面。以a凝集素为锚定蛋白,将内切菊粉酶基因展示在酿酒酵母EBY100细胞表面。对重组酿酒酵母EBY100/pYD1-Inuop的诱导表达发现,表面展示的内切菊粉酶的酶活为1.89 U/mg干细胞。以Pir1为锚定蛋白,构建了毕赤酵母表面展示载体pPIC9K-Pir1。将内切菊粉酶基因克隆到该载体中得到pPIC9K-Inuop-Pir1,重组质粒经Sac I线性化后电转入P.pastoris KM71中,得到重组毕赤酵母KM71/pPIC9K-Inuop-Pir1。对重组毕赤酵母的诱导表达发现,表面展示的内切菊粉酶的酶活为1.13 U/mg干细胞。