刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的原生动物,能够感染大部分哺乳动物,对怀孕和免疫功能受损的个体造成严重感染。细胞自噬形成的双层膜结构能够直接包裹弓形虫,与溶酶体融合后被降解。自噬相关蛋白(ATG)也被证明可能通过非典型自噬途径参与免疫应答。本课题探究了宿主自噬相关蛋白ATG5对弓形虫体外增殖和活力,以及对感染细胞的线粒体自噬调控的影响,为阐明该途径在弓形虫非特异性免疫作用机制奠定了基础。首先开展了对ATG5蛋白在树突状细胞(DCs)识别弓形虫中作用的探究。进行了鼠源ATG5的基因克隆和原核表达,分离培养小鼠骨髓源DCs进行体外感染试验。ATG5组CD11c~+CD83~+成熟型DCs所占比例显著高于弓形虫组(P<0.05),表明该重组蛋白对弓形虫诱导的DCs成熟有明显的抑制作用。其次构建了ATG5敲低和过表达的Vero细胞系。包装慢病毒载体用于感染Vero细胞,利用嘌呤霉素筛选得到稳定细胞系,通过RT-q PCR方法测定ATG5转录水平。结果sh ATG5-2的敲低效率达79%,过表达水平为对照的12.62倍。利用稳定株评价ATG5对弓形虫入侵能力的影响。观察弓形虫在各组细胞内的生长,经瑞氏-吉姆萨染色,400×显微镜下计算感染细胞占比。结果发现ATG5促进了弓形虫对Vero细胞的入侵、胞内增殖和逸出,反之敲低导致其推迟;并且ATG5的水平与弓形虫感染细胞的比例呈正相关。之后进一步探究宿主ATG5对弓形虫线粒体功能的影响。收集各组速殖子,用JC-1染料检测其线粒体膜电位去极化程度。结果显示过表达组速殖子线粒体膜电位去极化程度最高、敲低组最低,可见宿主ATG5加剧了对弓形虫线粒体功能的损伤。最后评价ATG5与弓形虫感染对宿主线粒体自噬水平的影响。各组细胞接种速殖子后不同时间通过RT-q PCR检测PINK1基因的水平。随着弓形虫的入侵、增殖和逸出,PINK1的水平呈先降低后升高再降低的趋势。三组细胞在感染前期PINK1相对表达量无显著差异,而在48 h后过表达组显著高于其他组(P<0.05),说明弓形虫在宿主细胞生长发育导致细胞内线粒体自噬水平产生变化,且在虫体感染后期这种变化同样受细胞ATG5的调控。综上所述,宿主细胞ATG5促进了弓形虫对Vero细胞的入侵、胞内增殖和逸出,但也加剧了其线粒体功能的损伤和DCs识别的降低;弓形虫胞内生长发育导致细胞线粒体自噬水平产生变化,且在虫体感染后期这种变化同样受细胞ATG5的调控。