论文部分内容阅读
视觉是人类最重要的感知觉。视网膜作为视觉感知的起点,负责将光信号转换为电信号以形成图像视觉和非图像视觉信息。已有研究表明,视网膜色素变性和老年黄斑变性等视网膜退行性疾病会引起光感受器细胞不可逆死亡最终导致失明,对人类的正常生活造成严重影响,但视网膜内其他类型细胞之间环路以及视网膜通往视皮层的神经环路仍保持完好。因此,人胚胎视网膜移植能够在一定程度上改善病人视力。然而,由于可用于移植治疗的人胚胎视网膜十分稀缺而且受到伦理问题的制约,视网膜退行性疾病的治疗受到了很大的限制。人多能干细胞体外培养体系的建立和视网膜细胞诱导分化方法的发展为视网膜退行性疾病的治疗提供了新的移植细胞来源和疾病治疗策略。目前基于基因和蛋白表达的研究表明,人多能干细胞分化得到的视网膜类器官拥有与人视网膜相似的细胞类型和细胞发育顺序,因而可以作为研究人视网膜发育和疾病的体外模型。然而,二者在发育过程中的染色质可及性和转录调控特征的相似程度并不清楚。此外,近期有关人视网膜的多组学研究揭示了人视网膜发育过程中的转录特征和组蛋白修饰特征,但研究领域内对人视网膜染色质可及性特征仍知之甚少。因此,对人视网膜和类器官的染色质可及性和转录调控特征的比较研究可以促进领域对人视网膜发育机制的理解,为类器官分化系统的改进以及类器官在视网膜退行疾病治疗的临床应用奠定基础。染色质可及性是指细胞核中DNase等大分子与染色质DNA的物理可接触程度,展现了染色质结构的开放程度,由核小体和其他染色质结合因子与DNA的结合情况所决定。在细胞发育和命运决定过程中,染色质可及性与基因表达调控紧密相关,受到DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和染色质重构等多种表观遗传特征的调控,进而影响RNA聚合酶Ⅱ或转录因子等因子与相应的顺式调控元件相结合。随着高通量测序技术的发展,转座酶可接近的染色质区域的高通量测序分析(ATAC-seq)从发明以来已被证明是一种灵敏、稳健而且操作简单的研究染色质开放程度的方法。ATAC-seq可以用于染色质开放区域、核小体结合位置以及转录因子富集和结合位置的研究,逐渐成为领域内主流研究的方法。在本论文研究中,我们收集了不同发育时间点的人胚胎视网膜样品和类器官样品的ATAC-seq和RNA-seq数据,系统地分析了人胚胎视网膜和类器官发育过程中染色质开放程度和转录表达水平的动态变化。实验结果揭示了人胚胎视网膜在发育中表现出特有的染色质开放状态和基因转录表达的动态变化,并且能够与早期细胞增殖、中期神经发生、晚期视网膜分化这三个大的发育阶段相对应;类器官发育中的染色质特征和转录特征与人胚胎视网膜有很大的相似性,但也存在不同的染色质开放特征。在此基础上,我们将ATAC-seq和RNA-seq数据进行整合分析,构建了人胚胎视网膜和类器官在发育过程中的转录调控网络,并展示了二者的相似性。值得注意的是,我们在分析中发现转录因子NFIB和THRA是人类视网膜发育所必需的调控因子。为了验证NFIB和THRA在人视网膜发育中的调控功能,我们使用类器官开展了基因操纵实验,系统而全面地建立了“人视网膜发育分子机制发现-视网膜类器官基因操作验证”的闭环研究体系,解决了当前难以直接在人视网膜上进行基因操作和功能验证的难题,也证明了视网膜类器官是人视网膜研究的良好体外模型。最后,由于组蛋白修饰是染色质的重要特征之一,我们收集已有数据对人类和小鼠视网膜发育中的组蛋白修饰和染色质开放特征进行比较分析。分析发现,人视网膜发育过程中存在同时拥有H3K4me3和H3K27me3修饰的二价修饰状态,而小鼠视网膜发育中并不存在。人视网膜发育中的这种特殊性暗示着人类基因组是通过更加复杂的表观遗传调控机制来调节神经发生过程,同时很可能成为今后组蛋白修饰相关视网膜发育或衰老疾病治疗的潜在靶点。综上所述,我们通过对视网膜发育过程中染色质特征和转录特征动态变化进行系统研究,描绘了人胚胎视网膜、人视网膜类器官与小鼠视网膜在发育过程中的染色质和基因表达特征图谱,填补了领域内对人视网膜发育表观特征研究以及人与小鼠物种间视网膜发育表观特征的比较研究的空缺。在此基础上,我们在表观水平和转录水平将人胚胎视网膜与类器官发育的时间段进行匹配,展现了人胚胎视网膜与类器官发育过程中表观和转录特征动态变化的异同。二者发育的相似性以及后续在视网膜类器官上的基因操纵实验共同证明了类器官可以作为研究人视网膜发育的体外模型。此外,本研究中发现的人胚胎视网膜与类器官发育中存在的差异特征可以在今后的研究中为以人体内视网膜发育特征为指导来改进视网膜类器官分化系统提供重要的研究基础和宝贵的数据资源,从而使类器官能够更好地模拟人体内视网膜细胞类型和分层结构,成为更完善的视网膜体外模型以满足临床应用的需求。总的来说,我们的工作在一定程度上为制备与人体内视网膜高度相似的视网膜类器官以及在未来临床应用上将视网膜类器官作为细胞或器官来源进行移植治疗视网膜相关疾病的目标奠定了坚实的基础。我们坚信通过不断解决临床应用前所面临的各种问题和挑战,在不久的将来,干细胞与类器官等再生医学技术能成为治疗包括视网膜退行性疾病在内的多种人类组织和器官疾病的有效方法,为人类的健康和生活提供更好的保障。