间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化能力的干细胞，有着潜在的临床应用价值。以往研究主要集中在人骨髓来源的间充质干细胞，但由于人骨髓来源的间充质干细胞的获得需要通过骨髓穿刺，而且其数量随年龄的增长而急剧下降，限制了人骨髓源间充质干细胞的应用。近年来有实验表明，MSCs还可从脐血、胎盘、羊水、脐静脉内皮下层、外周血及肌肉等组织中分离得到。其中，胎盘组织最受关注，它除了在胎儿发育、营养支持和维持耐受中发挥重要作用外，含有丰富的成体干细胞，成为寻找人类成体干/祖细胞的新组织来源。胎盘来源MSCs的表型、分化潜能与骨髓MSCs相似，且胎盘作为孕妇分娩后的废弃物，易于获得且对其研究和应用无伦理道德的争论，目前已成为间充质干细胞来源的新的研究热点。　　 胎盘羊膜中胚层(Amniotic Mesoderm)和绒毛膜中胚层（Chorionic Mesoderm）分别是体外分离获得羊膜间充质干细胞(Amniotic Mesenchymal stem cells，AMSCs)和绒毛膜间充质干细胞(Chorionic Mesenchymal stem cells，CMSCs)的组织来源，两者均由胚胎发育过程中的胚外中胚层(Extroembryonic Mesoderm)发育而来，但是随着胚外中胚层被分割并与不同的胚胎组织发生相互作用，分布于不同位置的胚外中胚层组织发生了不同的变化，这些变化是否会导致体外分离培养获得的MSC具有不同的生物学特性，进一步深入研究不同来源MSCs生物学特性，将为不同疾病模型的修复提供更有针对性的种子细胞。　　 本研究旨在建立了有效的AMSCs和CMSCs体外扩增体系，比较两群MSCs的生物学特性，并在此基础上，将AMSCs通过立体定向技术注入大鼠局灶性脑缺血MCAO模型（大脑中动脉闭塞脑出血模型，middle cerebral artery occlusion model，MCAO模型）脑内，观察植入细胞的存活、迁移、分化及大鼠神经功能恢复，初步探讨AMSCs移植治疗局灶性脑缺血的作用和可能机制。　　 第一部分AMSCs和CMSCs组织分布及体外扩增体系的建立。　　 目的:分析AMSCs、CMSCs在人胎盘组织中的分布特性、并建立相应的体外扩增体系。　　 方法:取健康产妇正常剖宫产之足月胎儿的新鲜胎盘组织，钝性分离羊膜层与绒毛膜层，采用不同方法对羊膜、绒毛膜组织进行消化及体外培养，倒置显微镜观察体外培养AMSCs、CMSCs的细胞形态;流式细胞仪分别检测其表面标志;采用多种诱导条件分别将两群MSC细胞向脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞方向诱导，并用特异性染色法对诱导后细胞进行鉴定。比较多种因子不同浓度下对CMSCs体外扩增效果，选取75ng/mlFL进一步比较其对两群MSC细胞的扩增效果，流式细胞仪检测优化培养条件下培养的两群MSC的细胞表型;细胞计数分析FL对两群MSCs的促增殖作用;RT-PCR分析两群MSC中FL受体flt3基因表达;分别将FL作用下的两群MSC细胞向脂肪细胞、软骨细胞及骨细胞方向诱导，RT-PCR分析脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞特异性基因在诱导后两群MSC细胞中的表达情况。　　 结果:(1)免疫荧光染色显示:羊膜组织中CD90和CD166阳性细胞主要分布于羊膜上皮和羊膜间质中，而绒毛膜组织中CD90和CD166阳性细胞主要分布血管内皮下、血管附近间质内;免疫组织切片染色结果显示:羊膜上皮、绒毛膜板间质内以及绒毛中轴血管周围间质内可见CD105阳性染色的细胞;(2)倒置显微镜观察AMSCs、CMSCs均呈典型的成纤维细胞样贴壁生长，流式细胞仪分析显示，两群MSC均高表达CD73、CD90和CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(3)体外扩增培养的AMSCs、CMSCs成骨诱导后，细胞均由长梭形向立方形转变，Von Kossa染色可见细胞呈集落生长并出现钙结节;成软骨诱导2周后，AMSCs、CMSCs形态逐渐变得扁平，anti-collagen typeⅡ免疫组织化学染色可见阳性细胞表达Ⅱ型胶原;成脂肪诱导2周，培养的两群MSC细胞内均有明显的脂滴出现，油红O染色阳性;(4)细胞计数结果表明，含FL的培养基能有效地促进两群细胞的体外增殖，且FL对CMSCs的促增殖作用更强;(5)流式细胞仪分析显示，含FL的培养基培养的两群MSC仍高表达CD73、CD90、CD105，不表达CD14、CD34、CD45和HLA-DR;(6) RT-PCR结果显示，AMSCs、CMSCs均表达flt3的mRNA;添加FL培养的两群MSCs向脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞诱导后，表达PLIN（脂肪细胞）、ACAN（软骨细胞）和RUNX2（骨细胞）特异性基因。　　 结论:从人胎盘羊膜、绒毛膜组织经过特定的分离消化后，能有效地获得AMSCs和CMSCs两群MSCs细胞，流式细胞术及诱导分化结果提示获得的两群MSCs均具有MSCs干细胞标志及诱导分化能力，可以成为体外优化培养的种子细胞;FL具有较强的促AMSCs、CMSCs体外增殖作用而对CMSCs的促增殖作用更为明显，同时其能保持两群MSCs的细胞形态、细胞表型及多向分化潜能，因此FL可以作为体外培养、扩增CMSCs的良好生长因子。　　 第二部分AMSCs和CMSCs生物学特性的比较。　　 目的:分析AMSCs、CMSCs的生物学特点，比较其向神经细胞分化和成血管潜能的差异。　　 方法:取培养2代以后的AMSCs、CMSCs细胞，采用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(1-Methyl-3-isobutylxanthine，IBMX)，对两群MSC细胞进行神经细胞方向诱导，继而采用PT-PCR方法对分化细胞诱导前及诱导后不同时间神经特异性蛋白表达情况进行比较分析，免疫细胞化学方法对分化的细胞进行鉴定;取培养2代以后的AMSCs和CMSCs细胞，将血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)诱导7天的两群MSCs接种于Matrigel胶上，利用基质胶上毛细血管样结构的形成实验比较两群诱导细胞的体外成血管能力。　　 结果:(1) RT-PCR结果显示，诱导前AMSCs表达nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tujl)以及GFAP，而CMSCs仅有nestin的表达;诱导两天后，AMSCs除了仍旧有nestin、mushashi-1、β-tubulinⅢ(Tuj1)、GFAP的表达以外，还有NF表达，但CMSCs仍旧只有nestin的表达;诱导五天后，AMSCs对各蛋白表达情况与诱导两天的结果相似，只是nestin的表达量有所下降，而CMSCs中除nestin以外，还有NF和GFAP表达，以上结果均说明AMSCs较CMSCs具有更好的神经生物学特性，更易于向神经元或神经胶质细胞分化;(2)基质胶上毛细血管样结构的形成实验显示，两群MSC细胞均能在基质胶上形成毛细血管样结构，但AMSCs较CMSCs形成毛细血管样结构慢;在毛细血管样结构的数目上，两种细胞间也有明显的差异，CMSCs形成的毛细血管样结构数明显多于AMSCs。　　 结论:在胎盘发育过程中，由于两群MSC细胞所接受的胚胎诱导不同，导致其表现出不完全相同的生物学特性，其中AMSCs表现出更强的神经前体样细胞的生物学特性而CMSCs具有较强的体外成血管能力。　　 第三部分AMSCs移植对于局灶性脑缺血的修复作用及可能机制。　　 目的:运用AMSCs移植治疗局灶性脑缺血，观察移植后实验动物神经功能的恢复情况，分析其可能的修复作用及相关机制。　　 方法:采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型，将脑缺血大鼠随机分为空白组和实验组，分别将PBS、BrdU标记的AMSCs通过立体定向植入大鼠纹状体内。分别于不同时间采用神经损伤严重缺损评分(Neurological Severity Scores，NSS)，平衡木试验(Beam Balance Test，BBT)，以及抬高身体摇摆试验(Elevated BodySwing Test，EBST)对实验动物的神经功能进行评分，8周后处死大鼠取脑组织，行HE染色、BrdU免疫组化染色，观察植入AMSCs的存活、迁移情况。　　 结果:应用线栓法短暂闭塞大鼠右侧大脑中动脉后，大鼠出现左侧肢体不同程度偏瘫同时伴有右侧Homer氏征。神经功能行为学检测显示:AMSCs移植大鼠NSS、BBT、EBST在细胞移植后1、3、6、8周与PBS对照组比较有显著好转(P＜0.01)，8周后，AMSCs组可见较多BrdU表达阳性的细胞，细胞集中在移植位点及周围区域，有向缺血灶迁移的趋势，局部无胶质增生和淋巴细胞浸润。　　 结论:AMSCs脑内移植能有效改善局灶性脑缺血大鼠的神经功能症状，是治疗局灶性脑缺血的一种可能措施。　　 综上所述，本课题建立了AMSCs和CMSCs有效的体外扩增体系，结合胚胎发育过程中，羊膜、绒毛膜各自的发育特点，比较两群MSCs向神经细胞分化及体外成血管的生物学特性的差异，并在此基础上，通过体内动物实验证实具有良好神经生物学特性的AMSCs在大鼠局灶性脑缺血MCAO模型的修复中效果显著，为进一步探讨AMSCs移植治疗局灶性脑缺血的机制及其临床运用提供了新的理论基础，具有原创性和潜在的应用价值。