副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起食源性疾病的一种重要致病菌,它常污染海产品如蟹、牡蛎、虾、贝等,从而引起食物中毒。中国国家食源性疾病监控网络数据显示,近年来沿海地区副溶血弧菌感染事件和人数呈明显上升趋势,甚至超过沙门氏菌跃居首位,因此,建立快速、灵敏的副溶血弧菌检测方法对于食品安全监控具有重要意义。以分子生物学为基础发展起来的聚合酶链式反应(PCR)技术,凭借其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优势,在副溶血弧菌的快速检测中具有广阔的应用前景。但是,目前文献报道的副溶血弧菌检测靶点不仅数量有限,且特异性不强,易造成假性结果。此外,抑制成分的存在也会干扰PCR扩增反应,出现假阴性检测结果。因此,为有效提高PCR检测方法的准确率,发掘新的检测靶点,并在PCR反应体系中加入指示假阴性的扩增内标是非常必要的。本研究致力于发掘新的检测靶点,并与人工构建的扩增内标相结合,建立水产品等食品中副溶血弧菌新的PCR检测体系,研究内容主要包括以下三个方面:一、副溶血弧菌种特异检测靶点的筛选及其验证本研究通过在线BLAST比对以及PCR评价等方法从61个候选靶点中筛选出一个特异强、灵敏度高的检测靶点(vp1332),并基于该靶点建立了两种PCR检测体系,即添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR检测体系与添加有扩增内标的荧光定量PCR检测体系。二、建立添加有扩增内标的副溶血弧菌常规PCR检测体系1)扩增内标的构建:在副溶血弧菌基因组中选取一段与目的基因(vp1332)同源性很低的序列,采用复合引物的方法构建扩增内标;2)PCR反应体系的优化:经过优化后,选择退火温度为58oC、Mg2+浓度为1.5 mmoL/mL以及扩增内标添加量为4.29×103拷贝/PCR,来建立副溶血弧菌常规PCR检测体系;3)特异性的评价:对309株副溶血弧菌和81株非副溶血弧菌进行PCR检测,结果显示,所有副溶血弧菌基因组DNA模板均可扩增到一条343 bp的目的条带,而以非副溶血弧菌DNA为模板则只能扩增到一条499 bp的扩增内标条带;4)灵敏度的评价:当扩增内标的添加量为4.29×103拷贝/PCR时,基因组DNA的检测灵敏度可达30.0 fg/μL,纯培养物的检测灵敏度为1.6×102 cfu/mL。当25 g无菌虾肉中人工污染有1.24 cfu的副溶血弧菌时,经过8 h的增菌培养即可得到阳性检测结果,整个检测过程能在12 h内完成;5)抗干扰能力的评价:当干扰菌浓度达109 cfu/mL并一起增菌12 h后或者当干扰菌基因组DNA的总添加量达21.5 ng/PCR时,均能检测到副溶血弧菌;6)准确度的评价:对7种(106份)食品样品进行检测,能够从中准确地检测出副溶血弧菌,同时,也能有效地指示假阴性。三、添加扩增内标的副溶血弧菌荧光定量PCR检测体系的建立1)扩增内标的构建:用复合引物的方法构建扩增内标,并设计相应的探针;2)PCR反应体系的优化:经过优化后,选择目的探针添加浓度为300 nM、扩增内标探针添加浓度为200 nM、扩增内标添加量为94拷贝/PCR,来建立副溶血弧菌荧光定量PCR检测体系;3)特异性的评价:对309株副溶血弧菌和81株非副溶血弧菌进行PCR检测,结果显示,所有副溶血弧菌的基因组DNA中均能采集到目的探针信号,而非副溶血弧菌基因组DNA中则只能收集到内标探针信号;4)灵敏度的评价:当扩增内标的添加量为94拷贝/PCR时,纯基因组DNA检测灵敏度可达2.4 fg/μL,纯培养物的检测灵敏度为1 cfu/PCR;5)抗干扰能力的评价:当干扰菌基因组DNA的总添加量为2.1μg或者干扰菌总量为107 cfu/mL(未增菌)时,均能检测到副溶血弧菌;6)准确度的评价:对7种(96份)食品进行副溶血弧菌检测时,能够从中准确地检测出副溶血弧菌,同时,也能有效地指示假阴性结果。本研究建立的副溶血弧菌内标PCR检测体系,能成功排除假阴性检测结果,整个检测过程快速、准确、特异、灵敏,有望成为副溶血弧菌法定检测方法,并应用于食品中副溶血弧菌的快速检测。