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实验目的缺血性脑血管病（Ischemic Cerebrovascular Disease,ICVD）是目前临床常见病,具有很高的致残率及病死率,并且也不再单纯是一种老年病,青年卒中患者在临床越来越常见,给患者家庭及社会带来沉重的负担。尽管在ICVD的病因、危险因素、一级预防、二级预防、药物治疗、介入治疗等方面取得了很大进展,但预防和治疗的有效性并不令人满意,我国ICVD发病率仍呈逐年上升态势。近年来,已发现缺血缺氧预处理（Ischemic Preconditioning,IPC）可有效减少动物局灶性组织缺血/再灌注损伤,最终在大脑中发挥保护作用[4]。诱导脑组织对后续致死性的脑缺血产生保护作用,这种迟发性的抵抗能力就是缺血耐受（Brain Ischemic Tolerance,BIT）。这为预防和治疗ICVD提供了新的方向。缺血预处理诱导产生缺血耐受的机制仍未清晰,目前研究认为预处理需要通过激活多个相互关联的信号通路才能产生缺血耐受,从而达到减少神经损伤和促进神经保护的目的。影响细胞活性的重要因素之一是细胞内的钙离子,脑组织缺血可引发神经细胞内钙超载,并导致神经细胞迟发性死亡。细胞内钙离子浓度升高引起细胞损伤的关键在于钙调神经磷酸酶（Calcineurin,CaN）的激活,它在大部分细胞信号传导途径里直接接受钙离子的调配,参与多种细胞的功能调节。钙调神经磷酸酶的重要生理底物之一是活化T细胞核因子（Nuclear Factor of Activated T cell,NFAT）,它是钙调神经磷酸酶的下游基因。Ca2+-CaN-NFAT信号通路中有一个密切相关的靶基因环氧化物酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）,该基因在心肌细胞、皮肤细胞及肺细胞中均与NFAT密切相关,NFAT是COX-2上游调控基因,可调控其蛋白表达[12-13]。实验发现皮肤中Ca2+-CaN-NFAT信号传导途径在黑色素瘤中表达[12],慢性心衰模型中抑制Ca2+-CaN-NFAT信号通路的传导已被证实可明显改善心衰预后[14]。Ca2+-CaN-NFAT通参与多种细胞的功能调节,而神经系统此信号通路的研究尚少。本实验以PC12细胞系建立缺血缺氧及缺血缺氧预处理模型,探讨缺血缺氧预处理中,Ca2+/CaN/NFAT在细胞凋亡过程中的作用及可能机制,了解钙离子载体A23187和钙离子阻断剂环孢菌素A（CyclosporinA,CsA）在缺血缺氧预处理过程中的作用。实验分组1、对照组:PC12细胞,1640培养液+10%胎牛血清+5%双抗（100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）;2、OGD实验组:PC12细胞贴壁后进行氧糖剥夺处理;3、Pre实验组:PC12细胞贴壁后进行氧糖剥夺预处理;4、A23187实验组:PC12细胞贴壁后加入A23187,培养24小时后进行氧糖剥夺预处理;5、CsA实验组:PC12细胞贴壁后加入CsA,培养24小时后进行氧糖剥夺预处理;6、A23187+CsA实验组:PC12细胞贴壁后加入A23187+CsA,培养24小时后进行氧糖剥夺预处理;7、DMSO实验组:PC12细胞贴壁后加入DMSO,培养24小时后进行氧糖剥夺预处理。实验方法1、培养PC12细胞（1640培养液+10%胎牛血清+5%双抗,37℃,5%CO2培养箱）;2、氧糖剥夺处理（OGD）（MEM培养液,37℃,5%CO2和95%N2缺氧箱中培养）;3、氧糖剥夺预处理（OGDP）（OGD前24h给予1.5h OGD处理）;4、MTT检测细胞存活率;5、Real Time PCR方法半定量检测CaN、NFAT及Cbl-b的mRNA转录水平;6、Western blot方法检测CaN、NFAT及COX-2蛋白的表达;7、统计学分析:所有数值为3-5次重复实验结果,采用SPSS22.0（Statistical Product and Service Solutions,统计产品与服务解决方案）进行单因素方差检验,数值以均值（mean）±标准差（Standard Deviation,SD）表示。实验结果1、细胞MTT测试:单纯缺血缺氧组较正常组的细胞生存率低（P<0.05）,单纯缺血缺氧组较缺血缺氧预处理组的细胞生存率低（P<0.05）。缺血缺氧预处理前24h予以CsA,PC12细胞的生存率高于予以A23187实验组的细胞（P<0.05）,缺血缺氧预处理前加入CsA细胞的生存率较单纯预处理组增加（P<0.05）,缺血缺氧预处理前加入A23187细胞的生存率较单纯预处理组降低（P<0.05）;2、Real Time PCR方法检测:缺血处理后CaN,NFAT和Cbl-b mRNA的表达显著高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。预处理后,CaN,NFAT和Cbl-b mRNA的表达较直接缺血组降低,差异有统计学意义（P<0.05）。三者在各组中的变化趋势是同向的;3、Real Time PCR方法检测:在缺血预处理前加入A23187后,与单纯预处理组相比,CaN,NFAT和Cbl-b的mRNA表达增加。加入CsA后CaN、NFAT及Cbl-b的mRNA表达较单纯预处理组减少,A23187和CsA联合应用后CaN、NFAT及Cbl-b的mRNA表达介于前两者之间;4、Western blot方法检测:缺血预处理显著降低NFAT、COX-2的表达（P<0.05）;在缺血预处理前加入钙阻滞剂CsA,CaN、NFAT及COX-2目的蛋白的表达量显著减少（P<0.05）;缺血预处理前加入钙载体A23187,CaN、NFAT及COX-2目的蛋白的表达量较单纯预处理实验组增加（P<0.05）。实验结论1、缺血组细胞生存率降低,CaN、NFAT、Cbl-b及COX-2表达增加,缺血预处理逆转了缺血导致的PC12细胞生存率的降低,对细胞产生保护作用,CsA提高了这种保护细胞的作用,而钙载体A23187有逆转这种保护的作用的趋势;2、A23187和CsA在缺血和缺血预处理过程中起重要的调节作用,提示细胞内Ca2+浓度的变化可能是缺血预处理过程中神经保护的诱发因素;3、缺血预处理可通过Ca2+-CaN-NFAT途径保护神经细胞。