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饲料效益一直是家蚕育种家所关注的经济性状。国内外学者研究认为二十世纪八十年代推广的蚕品种与前期推广的品种相比,虽然茧丝成绩有了显著提高,但蚕的消化率以及饲料效率没有变化；目前,我国生产上推广的蚕品种的饲料效率仍没有提高。桑叶是家蚕的主要饲料来源,家蚕从桑叶中摄取维持身体机能和成长所必需的各种营养成分。桑叶干物质由蛋白质、糖类、脂质等组成,其中,大部分蛋白质、脂质可以被蚕体吸收利用；由于蚕体中肠没有降解纤维素的相应的酶,作为桑叶细胞壁主要成分的纤维素的吸收率只有0.04%,不能被蚕儿吸收利用,是影响桑叶消化吸收的主要因素。转基因技术可使外源基因在转基因宿主细胞中整合、表达。利用转基因技术,可以打破自然条件下的种系隔离,使基因能在种系遥远的机体间流动。本研究首先从云斑天牛中肠组织中克隆到昆虫内源性纤维素酶Ⅱ基因(β-1,4-endoglucanase Ⅱ from the beetle, Batocera horsfieldi, Bh-EGase Ⅱ),在家蚕BmN细胞及家蚕幼虫中表达了重组酶Bh-EGase Ⅱ,并对该酶的活性进行分析,构建了可分泌Bh-EGaseⅡ基因的转基因载体,初步探讨了Bh-Gase Ⅱ基因对家蚕幼虫的糖代谢及茧质成绩的影响。获得的主要结果如下：1.云斑天牛内源性纤维素酶Ⅱ的cDNA克隆、表达和酶活性分析利用RACE方法从云斑天牛(Batocera horsfieldi)中肠组织中克隆出一个新的纤维素酶基因,即为Bh-EGase Ⅱ。该基因结构是由一个外显子组成,没有内含子。Bh-EGase Ⅱ属于糖苷水解酶家族45(Glycosyl hydrolase families45, GHF45),在其氨基酸序列的第36-48位置有1个GHF45非常保守的催化位点,并且具有3个N-糖基化位点。Bh-EgaseⅡ蛋白质的氨基酸序列中只有一个单一的催化结构域,不存在纤维素结合结构域和间隔序列,这与来源于桑天牛(Apriona germari)的Ag-Egase Ⅰ、 Ag-Egase Ⅱ以及白蚁后肠中的纤维素酶的氨基酸序列相类似。Bh-EGase Ⅱ与Ag-EGase Ⅱ的相似性达93.72%；与Ag-EGase Ⅰ的相似性达73.64%；与三化螟甲虫(O.albomarginata chamela)的β-1,4-葡聚糖内切酶的相似性达67.78%。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,在BmN细胞和家蚕5龄幼虫中表达出Bh-Egase Ⅱ。经SDS-PAGE检测和Western blot分析,结果显示：细胞裂解液中的蛋白质约为28kDa,而细胞上清液和家蚕幼虫血淋巴中的蛋白质约为33kDa。这可能是因为该基因有3个潜在的N-糖基化修饰位点,56-58(N-K-S)、99-101(N-S-T、237-239(N-Y-S),并有14个保守的半胱氨酸(C)残基,分泌到细胞外的蛋白经翻译后折叠、糖基化修饰后蛋白质分子量增大。Bh-EagseⅡ与Ag-Egase Ⅱ的相似度达93.72%,而Ag-Egase Ⅱ的99-101(NST)的N糖基化位点是该酶是否有活性的关键,这也是已知甲虫GHF45的纤维素酶的共性。用刚果红染色法检验了重组Bh-Egase Ⅱ的酶活性,结果是细胞裂解液中的重组Bh-Egase Ⅱ酶没有活性；与之相反,细胞上清液及幼虫血淋巴中的重组酶具有活性,这可能是因为后者经翻译后糖基化修饰及折叠所致。在BmN细胞上清液、幼虫血液中表达的Bh-EGase Ⅱ的酶活力大约是928U/mg,重组酶最佳pH值与最佳温度分别为pH6.0和50℃,在pH8.0-9.0、20-30℃时的酶活性能维持在60%左右,符合家蚕中肠的酸碱环境和家蚕饲养的适宜温度。实验结果有助于进一步了解Bh-Egase Ⅱ的基因结构和昆虫纤维素酶的酶学活性；该基因是一个转基因提高桑蚕纤维素利用效率的合适基因。2.转Bh-EGase Ⅱ基因载体的构建及在BmN细胞中的检验构建基于piggyBac的Bh-EGase Ⅱ的转基因表达载体,通过转染方法将重组质粒导入到家蚕BmN细胞中,利用荧光检测方法证明重组质粒中的报告基因eGFP获得表达；刚果红染色法检验了Bh-EGase Ⅱ酶的活性。本实验结果为进一步使转基因载体中的Bh-EGase Ⅱ在家蚕幼虫中的成功表达奠定了基础。3.利用外源Bh-EGase Ⅱ基因提高家蚕纤维素利用率的研究初探按照标准方法显微注射家蚕大造品种的早期胚胎,筛选获得了携带有绿色荧光标记基因的转基因阳性个体,建立单独的转基因品系。利用基因组PCR、反向PCR技术手段对转基因个体的插入位点进行了分子水平的检测,结果显示在转基因品系的大造基因组中插入了外源基因,插入位点位于第4号染色体上。用DNS比色法测定转基因家蚕肠腔中食物还原糖的OD540nm值,结果显示：转基因蚕还原糖的平均OD540值为0.429,均方差为0.0024；对照蚕还原糖的平均OD540值为0.381,均方差为0.0021,达显著差异(P<0.05)。结果说明整合到家蚕基因组中的外源Bh-EGase Ⅱ基因已在转基因个体中表达并分泌到肠腔中;分泌到肠腔中的Bh-EGase Ⅱ酶将肠腔食物中的纤维素降解,致使食物中的还原糖含量升高。家蚕6-磷酸果糖激酶-1(Bombyx mori phosphofructokinase, BmPFK)是糖酵解过程的关键酶。利用real time RT-PCR方法检测了转基因蚕的BmPFK mRNA的表达量。实验结果表明转基因家蚕中肠的BmPFK的mRNA的表达量是对照区的1.58倍,并达到显著差异(P<0.05),说明导入Bh-Gase Ⅱ基因后,不但使肠腔中的还原糖含量增高,而且使中肠细胞中的糖酵解循环加快。糖酵解与蛋白质代谢的关系紧密,糖酵解的中间产物可用于合成各种氨基酸的碳架结构,经转氨后可生成各种氨基酸；糖分解过程产生的能量可用于氨基酸和蛋白质的合成。对转Bh-Gase Ⅱ基因蚕的茧质成绩进行了调查,结果表明转基因蚕雌雄平均全茧量、茧层量为1.073g、0.134g,分别比对照提高3.5%、3.1%。推测：纤维素是促进食物在中肠蠕动的主要因素,纤维素的降解,减缓了蠕动速度,延缓了食物在中肠中的时间,使中肠细胞可以更充分地吸收食物中的营养成分；纤维素的降解也使糖酵解循环加快。这2种因素是转基因家蚕茧质成绩提高的主要原因。而有关糖代谢与蛋白质代谢的互作机制还有待于更深入的研究。本研究为育成实用新品种奠定基础。