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造血干细胞具有自我更新能力,并且可以向下游分化形成各种前体细胞和成熟血细胞。造血干细胞异常增殖和分化都可以导致严重的血液疾病。目前的研究已经发现了部分与造血干细胞自我更新以及分化相关的基因,如bmi1,hoxB4,wnt,pten,hedghog等,但是对整个分子调控网络的认识还十分局限。斑马鱼的造血调控网络与人类高度保守,因此,我们运用斑马鱼为模式生物筛选更多新的与造血干细胞自我更新及分化相关的基因。我们运用N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)为化学诱变剂处理雄性斑马鱼,保种获得了近1000家携带有突变基因的斑马鱼家系。通过运用标记定向造血干细胞的分子标记cmyb来筛选具有造血干细胞异常的突变家系,最终获得了200多个突变家系。通过经典的三代遗传学筛选,本课题最终选定了ldd794突变家系进行定位克隆,进一步阐述导致ldd794造血干细胞异常的分子机制。通过定位克隆,我们发现ldd794造血干细胞异常是由于DNA甲基转移酶1(Dnmt1)中的点突变导致蛋白翻译的提前终止。截断的Dnmt1缺失了DNA甲基化催化结构域,失去了甲基转移酶活性。Dnmt1可以通过对新复制的DNA加上甲基基团来调控基因的表达,但是其对造血调控的分子机制并不清楚。在dnmt1突变的胚胎中,定向造血干细胞的分子标记cmyb从受精后36小时(36hpf)开始就开始减少,到5dpf时完全缺失。全胚胎dUTP缺口标记(TUNEL)及造血干细胞的双标实验显示细胞没有发生异常的凋亡。通过磷酸化组蛋白3(PH3)的免疫荧光标记实验,我们发现dnmt1突变胚胎中造血干细胞的增殖能力显著减弱。进一步的分子机制研究发现增殖能力减弱是由cebpa基因表达上调所引起的,同时发现cebpa基因的转录调控区域DNA甲基化水平明显降低。过表达转录抑制形式的融合蛋白SUMO2-C/ebpa可以恢复造血干细胞减少的表型。同时,在dnmt1及cebpa双突变的胚胎中造血干细胞数量仍可维持正常,说明cebpa是Dnmt1对造血干细胞调控所必需的一个基因。在此课题中,我们运用正向遗传学的方法筛选得到了可遗传的携带有dnmt1突变的斑马鱼家系,并通过分子机制的探索发现cebpa是Dnmt1参与定向造血干细胞调控的一个关键基因。