论文部分内容阅读
背景:胃癌是常见的恶性肿瘤之一,在全球癌症死亡率中排名第二。虽然,医学在胃癌治疗方面取得一些进展,但是由于胃癌具有很高的发病率和死亡率,胃癌患者的存活率仍没得到明显改善。胃癌早期是可以通过手术切除的,但是由于胃癌早期缺乏特异性症状,导致大多患者确诊时已达进展期,丧失了手术时机,只能保守治疗。近年来,已经开发出治疗胃癌的新治疗技术,例如基因治疗和分子治疗,这些技术为治疗胃癌提供了新的出路。研究表明,胃癌的发生是基因突变积累的结果,因此寻找胃癌中发挥重要功能的靶分子基因至关重要。ITGB1(integrinβl)又名 CD29、FNRB、MDF2、VLAB、GP1IA、MSK12、VLA-BETA,是人类蛋白编码基因,基因全长58048 bp,位于人体第10号染色体上,包含18个外显子,共有3个转录变异体。ITGB1是整合素的家族成员之一,整合素是一类重要的细胞粘附分子,其通过与下游靶标的信号传递来促进癌症存活,增殖和运动。因此,研究ITGB1基因在肿瘤中的功能十分重要。CRISPR/Cas9源自化脓性链球菌的自我防御机制,现已经发展成一种新型的基因编辑技术,广泛用于基因工程。其原理是通过特异性sgRNA实现Cas9蛋白对靶基因的精确切割,引起靶基因的DNA突变,实现基因编辑。此方法操作方便,成本低廉,因此得到越来越多研究人员的青睐。目的:以CRISPR/Cas9技术建立ITGB1-/-SGC7901细胞系,在此基础上研究ITGB1对胃癌细胞恶性行为的调节作用,为胃癌防治新策略、新方法的研发提供新的思路和资料。方法:1.使用NCBI网站查找ITGB1的基因序列。找出ITGB1所有转录变异体的ORF区,找出共同部分。在共有的ORF区,分别在ITGB1的3、4、6外显子处,设计靶向ITGB1的三对sgRNA。设计的网站有:(1)http://crispr.mit.edu(2)http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html2.对设计的sgRNA进行合成、退火。提取Cas9载体PX459,Bbsl酶切载体,利用胶回收试剂盒回收酶切载体。最后,回收的载体片段与退火的sgDNA进行连接。3.将构建好的CRISPR/Cas9重组质粒转染SGC-7901细胞(转染效率需达到80%以上),用T7E1酶对sgRNA的活性进行检测(活性应大于25%)。接着Puro抗性筛选,将筛选完的细胞单克隆化培养,最终获得几个单克隆细胞。通过测序以及 Western Blot 确认 ITGB1+/-SGC7901 及 ITGB1-/-SGC7901 细胞系,之后对细胞扩大培养及冻存。4.敲除ITGB1后SGC7901细胞生物学行为的检测。利用损伤修复法、Transwell检测细胞的运动性;利用MTT、平板克隆形成实验测定细胞的增殖能力;通过考马斯亮蓝观察细胞骨架、扫描电镜观察细胞表面微结构;利用DAPI染色法观察细胞的凋亡。5.利用cBio Cancer Genomics Portal数据库对ITGB1生物信息学进行分析。结果:1.成功构建靶向ITGB1的CRISPR/Cas9重组载体。2.成功构建 ITGB1+/-SGC7901 及 ITGB1-/-SGC7901 细胞系。3.损伤修复法、Transwell结果证明,ITGB1敲除后,SGC7901细胞的迁移能力显著下降;MTT、平板克隆形成结果表明,ITGB1敲除后,SGC7901细胞的增殖能力明显减弱;考马斯亮蓝染色以及扫描电镜,实验表明ITGB1敲除后,SGC7901细胞的丝状伪足明显减少,癌细胞恶性明显降低;DAPI染色实验表明,ITGBI敲除后,SGC7901细胞有凋亡趋势,但无统计学差异。4.生物信息学结果表明ITGB1基因在很多肿瘤中都发生了变异,在胃癌基因组、mRNA水平都发生了突变;ITGB1突变使得胃癌患者的存活率明显下降;预测出与ITGB1相关基因及其互作网络图,为ITGB1的进一步研究奠定了理论基础。结论:利用CRISPR/Cas9技术,成功敲除ITGB1基因后,胃癌细胞的相关行为受到了影响。ITGB1可以明显促进胃癌细胞的Viability,Proliferation,Motility等细胞恶性行为;ITGB1可以明显强化胃癌细胞运动相关微结构的发育;ITGB1与胃癌细胞的凋亡相关但对凋亡影响较小。生物信息学结果表明,ITGB1在胃癌中发生了基因组和mRNA水平的变异;ITGB1突变明显降低胃癌患者的生存率。综上所述,ITGB1在胃癌发生、发展过程扮演着重要的促癌基因角色,参与胃癌细胞的增殖、迁移、凋亡等过程,可以作为胃癌的一个新型治疗靶点。