大肠杆菌表达系统是目前最常见、最稳定的外源蛋白表达系统，外源蛋白在大肠杆菌中表达时大多数是以无活性的不溶性包涵体(Inclusion bodies，IBs)形式存在，需要经过复杂、费时的变性和复性处理，形成正确的天然结构才能获得预期的生物活性。复性过程经常发生蛋白质的聚集使得复性产率降低，因此包涵体变复性技术至今仍是应用大肠杆菌表达系统制备蛋白质的主要瓶颈问题之一。　　 本研究主要针对包涵体蛋白变复性这一瓶颈问题，首先对课题组开发重组人粒细胞集落刺激因子(Granulocyte-colony-stimulating factor,G-CSF)新药过程中发明的一种包涵体双变性-复性技术(中国发明专利ZL96106778.0)进行了验证，并与传统的单一变性-复性方法进行了对比研究。阐明了双变性-复性方法可以通过第一变性剂盐酸胍和第二变性剂尿素的转换和几步简单的离心洗涤就使目的蛋白质的溶解度和复性收率大为提高，得到90％以上的可溶性蛋白收率，而且一步纯化就能使目的蛋白纯度达到95％，复性后蛋白生物活性与天然蛋白基本一致。从而证实先后采用两种变性剂进行包涵体蛋白交替溶解的“盐酸胍-尿素”双变性-复性体系是一种简单高效的重组蛋白包涵体复性方法，显示了非常好的应用潜力。　　 为了考察“盐酸胍-尿素”双变性-复性体系是否适用于其它包涵体蛋白的变复性过程，本论文对88种理化性质各异、来源于不同物种的具有重要生物学意义的重组蛋白质包涵体样本进行了双变性-复性实验，发现其中有67％的被试包涵体通过第一变性剂盐酸胍变性析出和第二变性剂尿素变性，其复性后的可溶性蛋白收率可达到90％以上，表明双变性-复性方法具有较好的通用性，具备进行深入研发的价值。　　 为了发现双变性-复性方法的复性规律，阐明其作用机理，本论文在上述88个样本中选取以E.coli BL21(DE3)/pET22b进行表达，同时在“盐酸胍-尿素”双变性-复性体系中其二次变性行为与G-CSF一致的36个包涵体样本进行了蛋白理化特性与复性收率的关联分析，应用统计学方法建立了回归模型。该模型提示：在选取的36个样本蛋白特性中，等电点可能是影响双变性-复性过程蛋白收率的一个重要因素，等电点每升高一个单位，相应的复性收率会降低14.83％；此外蛋白质的分子量及螺旋，折叠结构的增加也会对复性过程蛋白的收率产生不利影响，而转角结构的存在对收率的提高产生一定的促进作用。但这些因素对复性收率的影响不具显著性。基于上述研究结果，针对等电点与复性收率的关系，本论文进一步对选取的样本进行了等电点与复性收率关系的研究。结果显示以盐酸胍为第一变性剂、尿素为第二变性剂的双变性-复性体系更适用于等电点在6.0以下的包涵体蛋白的复性。而对等电点在6.0以上的包涵体蛋白的变复性则具有不确定性。预示对于这类包涵体(pI＞6.0)变性和复性的突破将是后续双变性-复性方法研究的重点。　　 为拓展双变性-复性体系，增加该方法的应用范围，本研究以重组绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)包涵体为模型，开发了一种新的双变性-复性方法。新方法选取含有精氨酸的碱性溶液作为第一变性剂体系，通过梯度降低变性液的pH值析出溶解的包涵体，然后再以尿素为第二变性剂进行变性，随后进行稀释复性。结果显示新体系与原盐酸胍-尿素的双变性-复性体系相比，绿色荧光蛋白包涵体复性速度与生物活性均有提高。随后在4个包涵体上的验证证明，该新的精氨酸-尿素双变性体系的建立拓展并完善了双变性-复性技术，为进一步开发新的双变性-复性体系，研究双变性-复性技术的机理奠定了基础。　　 本研究最后还应用双变性-复性技术，对难以获得活性产物的日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶(Schistosoma japonicum cercarial elastase-2b，SjCE-2b)包涵体进行了复性，获得了有活性的酶，并对该酶的性质进行了初步研究。该酶在血吸虫对宿主皮肤的侵入作用、消化作用和免疫应答等生物过程中发挥着重要作用。活性酶的获得再次证明了双变性-复性方法在重要蛋白质研究中的应用潜力。　　 综上，本论文通过大量样本的双变性-复性实验，对双变性-复性技术进行了详细的研究，初步证明了该技术具有良好的潜在应用价值，并通过建模分析阐明了蛋白质等电点与双变性-复性方法应用范围的关联度。同时，在双变性-复性思想的指导上，开发了一种新的精氨酸-尿素双变性体系，完善了双变性-复性技术体系，拓展了双变性-复性方法的应用价值。本研究涉及的研究方法与技术对于应用大肠杆菌进行重组蛋白质的批量化制备具有重要价值。